E. coli-ի և այլ գաղութների տեսքի մեկնաբանումը EMB ագարի վրա

Ուսանողն անհայտ մանրէի նմուշը շտրիխներով ցանում է էոզին-մեթիլեն կապույտ ագարի վրա, ինկուբացնում ամբողջ գիշեր և վերադառնալիս տեսնում կանաչավուն փայլով մուգ գաղութներ։ Լաբորատոր մատյանում գրում է՝ «E. coli, հաստատված է»։ Այդ գրառումն ավելի շատ բան է պնդում, քան կարելի է հիմնավորել այդ ցանքսով։ Ագարի վրա երևում է որոշակի պայմաններում աճի և ֆերմենտացման ֆենոտիպը։ Տեսակային պատկանելությունն առանձին պնդում է, որը պահանջում է առանձին ապացույցներ։

Այս ուղեցույցում EMB ագարի արդյունքները դիտարկվում են որպես մեկնաբանման խնդիր։ Այն բացատրում է հիմքում ընկած սկզբունքը, ներկայացնում վերահսկիչ նմուշներով պատկերազարդ ատլաս և նշում այն դեպքերը, երբ դասագրքային պատկերը կարող է մոլորեցնել։

Ագարի հիմքում ընկած սկզբունքը

EMB ագարը և՛ ընտրողական, և՛ տարբերակիչ միջավայր է։ Էոզին Y և մեթիլեն կապույտ ներկանյութերը ճնշում են բազմաթիվ Գրամ-դրական օրգանիզմների աճը, ուստի միջավայրը նպաստում է Գրամ-բացասական մանրէների աճին։ Նույն ներկանյութերը նաև ցուցիչներ են․ երբ օրգանիզմը ֆերմենտացնում է առկա շաքարը և տեղային առումով բավարար թթու արտադրում, գաղութն առատորեն կլանում է ներկանյութը՝ դառնալով մուգ մանուշակագույնից մինչև կապտասև։ Թթվի ինտենսիվ արտադրության դեպքում գաղութի մակերեսին կարող է առաջանալ մետաղական կանաչ ծիածանափայլ։ Էոզին-մեթիլեն կապույտ ագարով թիթեղների ASM արձանագրությունը նկարագրում է ընտրողականության և տարբերակման այս համադրությունը և ուսուցման համար տրամադրում է համեմատական լուսանկարներ։

Ցանկացած արդյունք մեկնաբանելուց առաջ կարևոր է մի մանրուք՝ ստուգել, թե որ բաղադրությունն է օգտագործվում։ Holt Harris Teague-ի ավելի հին բաղադրությունը պարունակում է լակտոզա և սախարոզա, մինչդեռ Levine EMB-ն՝ միայն լակտոզա։ Սախարոզան ֆերմենտացնող, բայց լակտոզան չֆերմենտացնող օրգանիզմը, օրինակ՝ Serratia marcescens-ի բազմաթիվ մեկուսացված շտամներ, այս երկու տարբերակների վրա կարող է տարբեր տեսք ունենալ։ EMB միջավայրերի արտադրողի փաստաթղթերում բաղադրությունների այս տարբերությունը հստակ նշված է։ Արդյունքի հետ միասին մատյանում գրանցեք արտադրողին և միջավայրի բաղադրությունը։

Պատրաստված, չցանված EMB ագարը սովորաբար կարմրաշագանակագույնից մինչև կարմրամանուշակագույն է, երբեմն՝ կանաչավուն երանգով կամ մանր նստվածքով։ Այդ ֆոնային գույնը աճ չէ։ Յուրաքանչյուր դիտարկում համեմատեք չցանված թիթեղի կամ փաստագրված սկզբնական տեսքի հետ, իսկ առաջնային ցանքսը գնահատեք 35-ից 37 C ջերմաստիճանում մոտ 18-ից 24 ժամ աերոբ ինկուբացումից հետո, եթե ուսումնական արձանագրությունն այլ պայմաններ չի սահմանում։ Երկարատև ինկուբացումը կարող է փոխել ֆերմենտացման արտաքին պատկերը։

Ինչպես դիտարկել թիթեղը

Օգտագործեք լուսավորման երկու եղանակ։ Նախ զննեք թիթեղն անդրադարձված կամ թեք լույսի տակ և թեքեք այն․ մետաղական փայլը ծիածանափայլ է և կարող է հայտնվել կամ անհետանալ՝ կախված դիտման անկյունից։ Այնուհետև դիտարկեք անցնող լույսով՝ գաղութների գույնն ու մուգ կենտրոնները գնահատելու համար։ Աշխատեք լավ առանձնացված գաղութներով, քանի որ խիտ աճն ու հարևան գաղութները փոխում են թթվի տեղային կուտակումը և կարող են թուլացնել կամ ուժեղացնել գունավորումը։ ASM պատկերների հավաքածուն դա ուղղակիորեն ցույց է տալիս․ խառը կուլտուրայում E. coli-ն կարող է կորցնել ակնկալվող փայլը, քանի որ շրջապատող օրգանիզմները փոխում են թթվային միջավայրը։

Ներառեք վերահսկիչ նմուշներ, երբ առաջադրանքը դա թույլ է տալիս։ Ուսուցման մեջ տարածված հավաքածուն ներառում է E. coli ATCC 25922-ը՝ կապտասև գույնի և մետաղական փայլի ֆենոտիպի համար, չֆերմենտացնող մանրէ, օրինակ՝ Salmonella Typhimurium ATCC 14028-ը կամ Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-ը՝ անգույն ֆենոտիպի համար, և Գրամ-դրական մանրէ, օրինակ՝ Enterococcus faecalis-ը կամ Staphylococcus aureus-ը՝ որպես աճի ճնշման վերահսկիչ նմուշ, ինչպես նշված է EMB միջավայրերի որակի վերահսկման ստանդարտ աղյուսակներում։ Եթե դրական վերահսկիչ նմուշը փայլ չունի, նախ կասկածեք ինկուբացման պայմաններին, խիտ աճին կամ միջավայրի բաղադրությանը, ապա միայն՝ անհայտ նմուշին։

Թիթեղների պատկերազարդ ատլաս

Ստորև ներկայացված թիթեղները գեներացված նկարազարդումներ են, ոչ թե իրական կուլտուրաների լուսանկարներ։ Դրանք ցույց են տալիս, թե ինչ պատկեր պետք է փնտրել, այլ ոչ թե որևէ առանձին շտամի ճշգրիտ երանգը։ Համեմատեք դրանք ASM համեմատական լուսանկարների և ուսումնական լաբորատորիայի իրական ցանքսերի հետ։

Թիթեղ 1․ Escherichia coli-ն EMB ագարի վրա՝ լակտոզան ինտենսիվ ֆերմենտացնող մանրէ

E. coli-ն EMB ագարի վրա սովորաբար մուգ մանուշակագույնից մինչև կապտասև է, հաճախ՝ մուգ կենտրոնով և թթվի ինտենսիվ արտադրությունից առաջացող մետաղական կանաչ փայլով։ Այդ փայլն այն հայտնի նշանն է, որը փնտրում են ուսանողները, սակայն այն դիտարկեք որպես օժանդակ ապացույց, ոչ թե որոշիչ չափանիշ։ Փայլի ինտենսիվությունը տարբերվում է՝ կախված շտամից, ինկուբացման տևողությունից, գաղութների խտությունից և դիտման անկյունից։ Փայլի բացակայությունը չի բացառում E. coli-ն, իսկ առանց փայլի մուգ գաղութը կարող է վկայել նաև մի շարք այլ ֆերմենտացնող մանրէների մասին։ Հետագա ցանկացած աշխատանքի համար ընտրեք լավ առանձնացված գաղութ՝ խիտ աճով հատվածից եզրակացություններ անելու փոխարեն։

Թիթեղ 2․ Klebsiella pneumoniae-ն EMB ագարի վրա՝ լորձանման գաղութներ առաջացնող ֆերմենտացնող մանրէ

Klebsiella pneumoniae-ն EMB ագարի վրա սովորաբար առաջացնում է մեծ, փայլուն, լորձանման գաղութներ՝ վարդամանուշակագույնից մինչև շագանակամանուշակագույն երանգներով, հաճախ՝ մուգ կենտրոններով, բայց սովորաբար առանց ուժեղ մետաղական փայլի։ Նման մորֆոլոգիա հանդիպում է նաև հարակից ֆերմենտացնող մանրէների, օրինակ՝ Enterobacter-ի դեպքում։ Լորձանման կառուցվածքը և գաղութի չափը մեկնաբանման մաս են․ փոքր և տափակ վարդագույն գաղութն այլ նշանակություն ունի, քան մեծ, գմբեթաձև, լորձանման գաղութը։ Ինչպես E. coli-ի դեպքում, ագարի պատկերը հուշում է ֆերմենտացման ֆենոտիպը, իսկ տեսակային նույնականացման համար անհրաժեշտ է ստորև նկարագրված կենսաքիմիական հաստատումը։

Թիթեղ 3․ Salmonella-ն EMB ագարի վրա և այլ չֆերմենտացնող մանրէներ՝ անգույն գաղութներ

Salmonella-ն EMB ագարի վրա և լակտոզան չֆերմենտացնող հարակից մանրէները, ներառյալ Shigella-ն ու Pseudomonas-ի բազմաթիվ մեկուսացված շտամներ, սովորաբար աճում են որպես անգույն, կիսաթափանցիկ կամ բաց սաթագույն գաղութներ։ Որոշ բաղադրություններ և պայմաններ թույլ վարդագույն երանգ են տալիս, ուստի բաց վարդագույն գաղութն ինքնաբերաբար չի նշանակում ֆերմենտացնող մանրէ։ EMB-ն չի տարբերակում Salmonella-ն Shigella-ից կամ այլ չֆերմենտացնող մանրէներից․ այդ տարբերակումը կատարվում է հետագա փորձերով։ Նկատի ունեցեք նաև, որ փաստագրվել են լակտոզա-դրական Salmonella շտամներ՝ E. coli-ին նման մետաղական փայլով գաղութներով, ինչը ևս մեկ պատճառ է, որ միայն մեկ թիթեղի պատկերը վերջնական եզրակացության համար բավարար չէ։

Թիթեղ 4․ Serratia marcescens-ը և բաղադրության հետ կապված թակարդը

Serratia marcescens-ին առանձին բաժին է հատկացված, քանի որ ուսանողները հաճախ ակնկալում են կարմիր գաղութներ և հետո սխալ են մեկնաբանում պատկերը։ Կլինիկական մեկուսացված շտամների մեծ մասը չի ֆերմենտացնում լակտոզան, ուստի Levine EMB-ի վրա դրանք սովորաբար լինում են գունատ կամ թույլ գունավորված։ Քանի որ շատ շտամներ ֆերմենտացնում են սախարոզան, սախարոզա պարունակող միջավայրը կարող է առաջացնել ավելի մուգ գունավորում կամ թթվի արտադրության հետ ավելի արտահայտված ռեակցիա։ Մի ակնկալեք նաև դասական կարմիր պրոդիգիոզին պիգմենտը 35-ից 37 C ջերմաստիճանում․ ինկուբատորի ջերմաստիճանում պիգմենտի արտադրությունը անկայուն է։ Երբ արձանագրության մեջ նշվում է Serratia marcescens-ը EMB ագարի վրա, ստուգեք, թե որ բաղադրությունն է ենթադրվում այդ նկարագրության մեջ։ Serratia-ի նյութափոխանակության ակնարկը ամփոփում է այս թակարդի հիմքում ընկած պատկերը՝ լակտոզայի նկատմամբ բացասական և սախարոզայի նկատմամբ փոփոխական ռեակցիաները։

Թիթեղ 5․ վերահսկիչ նմուշներ և ճնշված աճով օրգանիզմներ

Գրամ-դրական օրգանիզմների, օրինակ՝ Staphylococcus-ի, Enterococcus-ի, Streptococcus-ի և Bacillus-ի աճը EMB ագարի վրա սովորաբար արգելակվում կամ զգալիորեն ճնշվում է, թեև ոչ բոլոր շտամների համար է արգելակումը բացարձակ։ Վերահսկիչ նմուշների հավաքածուն թույլ է տալիս հիմնավորված մեկնաբանություն անել․ E. coli-ի վերահսկիչ նմուշը պետք է լավ աճ ցույց տա՝ կապտասև գույնով և փայլով, չֆերմենտացնող վերահսկիչ նմուշը՝ անգույն աճ, իսկ աճի ճնշման վերահսկիչ նմուշը՝ թույլ աճ կամ աճի բացակայություն։ Եթե աճի ճնշման վերահսկիչ նմուշը լավ է աճում, ընտրողականության փուլը ձախողվել է, և այդ խմբաքանակի մնացած բոլոր արդյունքները կասկածելի են։ Ներկման մեթոդները պատասխանում են այլ հարցի, քան կուլտիվացման միջավայրերը․ լաբորատոր ապակու վրա ներկման մասին տե՛ս մեթիլեն կապույտով ներկման ատլասը։

Համեմատություն՝ սահմանների հստակեցմամբ

Երեք նախադասություն ամփոփում են մոլորեցնող արտաքին պատկերները։ Մուգ գույնը չի նշանակում E. coli, քանի որ Klebsiella-ն, Enterobacter-ը և այլ ֆերմենտացնող մանրէներ առաջացնում են մուգ կենտրոններ՝ առանց փայլի։ Վարդագույնը չի նշանակում Klebsiella, քանի որ չափավոր կամ դանդաղ ֆերմենտացնող մանրէները և որոշ սովորաբար չֆերմենտացնող համարվող մանրէներ կարող են վարդագույն կամ բաց մանուշակագույն լինել։ Փայլը չի նշանակում միանշանակ E. coli, քանի որ այլ ինտենսիվ ֆերմենտացնող մանրէներ ևս կարող են այն առաջացնել։ Ուսումնական արձանագրությունն ու դրա խառը կուլտուրաների պատկերները ցույց են տալիս այս սխալ եզրահանգումներից յուրաքանչյուրը։

Հաստատման սահմանները

EMB ագարը ցույց է տալիս ֆենոտիպը, ոչ թե տեսակը։ Տարբեր օրգանիզմներ կարող են ունենալ գաղութների նույն տեսքը, իսկ նույն օրգանիզմը կարող է շեղվել իր դասագրքային պատկերից՝ կախված շտամից, տարիքից, աճի խտությունից, միջավայրի բաղադրությունից և ինկուբացումից։ Այդ պատճառով ուսումնական և կլինիկական աշխատանքային ընթացակարգերում EMB-ի մորֆոլոգիան դիտարկվում է որպես նախնական տվյալ։

Ուսանողի համար հիմնավոր աշխատանքային ընթացակարգն այսպիսին է․ նկարագրել առանձնացված գաղութը՝ չափը, գույնը, կենտրոնը, թեք լույսի տակ փայլը և լորձանման բնույթը, գրանցել միջավայրի բաղադրությունը, ինկուբացման տևողությունն ու ջերմաստիճանը և վերահսկիչ նմուշների արդյունքները, ապա լավ առանձնացված գաղութը վերացանել՝ մաքուր կուլտուրա ստանալու համար, մինչև որևէ հաստատող փորձ։ Տարածված հետագա քայլերն են Գրամի ներկումը և IMViC ռեակցիաները՝ E. coli-ի և կոլիֆորմների նախնական նույնականացման համար, TSI-ն կամ KIA-ն և օրգանիզմին հատուկ կենսաքիմիական փորձերի հավաքածուները՝ աղիքային մանրէների համար, ինչպես նաև շճաբանական, MALDI TOF կամ այլ վավերացված նույնականացման մեթոդներ, երբ առաջադրանքը դա պահանջում է։ Աղիքային մանրէների ընտրողական և տարբերակիչ միջավայրերի շարքում EMB-ի տեղը հասկանալու համար տե՛ս աղիքային մանրէների կուլտիվացման միջավայրերի ներածական նյութերը և Գրամի ներկմամբ հետագա ստուգումը։ Իսկ այն հարակից հարցի վերաբերյալ, թե ապակու վրա կապույտ ներկումն ինչ կարող է և ինչ չի կարող ապացուցել, մեթիլեն կապույտով ներկման ատլասը նույն սկզբունքով տարանջատում է դիտարկումն ու եզրակացությունը։

Նախ գրեք դիտարկումը, ապա՝ եզրակացությունը։ «Levine EMB-ի վրա 24 ժամ հետո մուգ կապտասև գաղութներ՝ դիտման անկյունից կախված կանաչ փայլով, ինչը համապատասխանում է լակտոզայի ինտենսիվ ֆերմենտացմանը» ձևակերպումը հիմնավոր է։ «E. coli, հաստատված է» ձևակերպումը պահանջում է հաստատման այն քայլը, որը միայն ագարի պատկերը չի կարող ապահովել։