Reaktív oxigénformák mérése metilénkék-kísérletekben

Két laboratórium olyan kísérletet végez, amelyet mindkettő a metilénkék antioxidáns hatását vizsgáló kísérletnek nevez. Az egyik arról számol be, hogy a festék visszaszorítja a reaktív oxigénformákat. A másik szerint létrehozza őket. Mindkettő egyértelmű dózis–válasz görbéket mutat be. Mindkettő jóhiszeműen jár el. Az eltérés nem csalásból vagy hozzá nem értésből fakad. Hanem abból, hogy a két csoport eltérő dolgokat mért, eltérő megvilágítás mellett, más-más kérdésre választ adó szondákkal, majd mindkét választ ugyanazzal a szóval írta le: ROS.

A metilénkék pontos mérése éppen azért nehéz, mert részt vesz abban a kémiai folyamatban, amelyet meg kellene figyelnie. Sötétben elektronokat közvetít donorok és akceptorok között, majd visszatér kiindulási formájába, készen az újabb ciklusra. Fény hatására fotoszenzibilizátorrá válik: gerjesztett triplettállapotba kerül, amelyből energiát adhat át az oxigénnek, szingulett oxigént képezve, vagy elektronátadással gyököket és hidrogén-peroxidot hozhat létre. A rendszerbe helyezett bármely szondát maga a festék oxidálhatja, redukálhatja, kifakíthatja, vagy optikailag elfedheti. Ezért egy ROS-mérés első kérdése soha nem az, hogy mekkora a kapott szám. Hanem az, hogy valójában mit észlel a mérési eljárás, és hogyan befolyásolja azt a festék.

Amplex Red: kalibrált hidrogén-peroxid-mérés

A metilénkék és az Amplex Red kombinációja e szakirodalom leginkább megalapozott párosítása, ha megfelelően állítják be. A kémiai reakció specifikus: a tormaperoxidáz hidrogén-peroxid felhasználásával az Amplex-szubsztrátot fluoreszcens termékké, rezorufinná oxidálja, nagyjából egy az egyhez sztöchiometriai arányban. A mintában lévő peroxid a detektorban fluoreszcenciaként jelenik meg. A hagyományosan ROS-nak tekintett vegyületcsoport más tagja közvetlenül nem hajtja ezt a reakciót.

A döntő előny a kalibrálás. A gondos kísérletező ismert koncentrációjú peroxidstandardokat mér ugyanabban a pufferben, azonos peroxidáz- és szubsztrátkoncentrációval, azonos inkubációs idővel és optikai beállításokkal, majd ehhez a görbéhez viszonyítja a mintákat. Az izolált agyi mitokondriumokkal végzett, e módszert megalapozó vizsgálatban a szerzők pontosan így jártak el: minden mérés végén ismert mennyiségű peroxidot adtak a rendszerhez, és az eredményeket önkényes fluoreszcenciaegységek helyett fehérjemilligrammonként és percenként megadott pikomolban, sebességként közölték. Ettől válik a fénylés méréssé.

A vizsgálat három részletét érdemes követni. Először is a szerzők a jelet peroxidbontó katalázzal ellenőrizték. A metilénkék által kiváltott fluoreszcencia-növekedés kataláz hozzáadásakor megszűnt, megerősítve, hogy a jel peroxidból származott, nem optikai műtermék volt. Másodszor közvetlenül tesztelték a megvilágítás hatását: a gerjesztő fénynyalábot zár segítségével úgy szabályozták, hogy a minták a szokásos fénydózis egy nyolcadát kapják, és a jel mindössze kilenc százalékkal csökkent. Az általuk kimutatott peroxid több mint kilencven százaléka független volt a méréshez használt fénytől. Harmadszor elektróddal külön mérték a peroxid eltávolítását, és azt találták, hogy a festék egyszerre fokozta a képződést és lassította az eltávolítást. Egy kizárólag a nettó fluoreszcenciát jelző szonda összemosta volna ezt a két hatást.

A mérési eljárásnak így is vannak hibalehetőségei, és a metilénkék ezek közül többet is előhoz. A festék széles tartományban nyeli el a fényt ugyanabban a vörös régióban, ahol a rezorufin fényt bocsát ki, így nagy festékkoncentrációnál a minta belső szűrőhatások révén elfedheti a saját jelét. A standardoknak ezért a mintákkal azonos festékkoncentrációt kell tartalmazniuk. Az Amplex Red önmagában is fotooxidálódhat, terméke, a rezorufin pedig szuperoxidot és peroxidot termelő fotoredoxciklusokba léphet. Ez különösen fontos akkor, ha a kísérletben egy fotoszenzibilizátort is megvilágítanak. A gyakorlati megoldás az, hogy először a metilénkékes mintákat sugározzák be, majd azok aliquotjait sötétben mérik az Amplex-reagensekkel, ahelyett, hogy a festéket és a szondát együtt világítanák meg. Végül a szuperoxid-diszmutáz nem egyszerűen csökkenti az Amplex-jelet: a szuperoxid peroxiddá alakítása növelheti is azt. A fluoreszcenciát fokozó SOD-kontroll nem vallott kudarcot. Azt mutatta ki, hogy a reakcióút korábbi lépésében szuperoxid vesz részt.

DCFDA: nem specifikus oxidációs indikátor

A metilénkék és a DCFDA párosítása okozza a legtöbb félreértést. A DCFH-DA a sejtekbe bejuttatható előanyag. A sejten belüli észterázok eltávolítják róla az acetátcsoportokat, így nem fluoreszcens DCFH marad vissza, amelynek oxidációja fluoreszcens DCF-et eredményez. Az oxidálószerek listája hosszú: hidroxilgyökök, peroxidáz- és hemköztitermékek, nitrogén-dioxid, hipoklórossav, valamint peroxinitritből származó gyökök. A hidrogén-peroxid önmagában semmilyen érdemi sebességgel nem oxidálja közvetlenül; a peroxidfüggő fluoreszcenciához általában vas, hemfehérjék vagy peroxidázreakciók részvétele szükséges.

Az a kritikai elemzés, amelyre minden módszertani résznek hivatkoznia kellene, Kalyanaraman és munkatársai DCFH-szondáról készített értékelése, amelyet a DCFDA-t emiatt elvető agyi mitokondriumvizsgálat is összefoglal. Kimutatták, hogy a szonda lassan, nem jellemzett sztöchiometriával, érvényes kalibrálás nélkül reagál, ráadásul nem ROS-vegyületekkel is. A szonda emellett felerősíti azt, amit mér: a DCFH egyelektronos oxidációjával DCF-gyök keletkezik, amely oxigénnel reagálva szuperoxidot hoz létre, ez pedig diszmutációval további peroxiddá alakul. A mérés részben maga állítja elő azt a kémiai folyamatot, amelyről beszámol.

Mindez nem teszi használhatatlanná a DCFDA-t. Előzetes szűrővizsgálatra teszi alkalmassá, nem azonosításra. A DCF-fluoreszcencia növekedése azt jelenti, hogy fokozódott a szonda oxidálószer-függő oxidációja. Nem jelenti azt, hogy nőtt a peroxid mennyisége, és végképp nem jelenti az összes ROS mennyiségének növekedését: ezt egyetlen szonda sem méri. A korábbi metilénkék-vizsgálatok, amelyek egy mikromoláris koncentráció felett DCF-oxidációra támaszkodtak, prooxidáns hatásokról számoltak be, míg ugyanebben az időszakban más rendszerekben a peroxid által kiváltott sejthalállal szembeni védelmet írtak le. Eltérő redoxkörnyezetekben ugyanarra a festékre mindkét megfigyelés igaz lehet, és a DCF-eredmény önmagában nem mondja meg, melyik oxidálószer adta a jelet. A korábbi agyi mitokondriumvizsgálat jelentősége abban áll, hogy ezt a szűrővizsgálatot kalibrált peroxidmérésre cserélte, és közvetlenül kimutatta a terhelést: már száz nanomoláris festékkoncentráció is többszörösére növelte a peroxidfelszabadulást minden vizsgált szubsztrát és légzési állapot mellett.

A DCFDA még egy, kifejezetten a metilénkékre jellemző buktatót rejt. A festék intenzíven színezett és redoxaktív, így kifakíthatja a fluoreszcenciát, kiolthatja az emissziót, vagy a sejtek ROS-termelésétől függetlenül oxidálhatja a szondát. A festéket és szondát tartalmazó, de sejt nélküli kontroll nem választható díszítőelem. Ez az a kísérlet, amely megmutatja, hogy a festék kölcsönhatásba lép-e a szondával.

Spincsapdázás és oxigénfelvétel: azonosítás és fluxus

Míg a fluoreszcens szondák azt jelzik, hogy megjelent valami, ami oxidációt válthat ki, a spincsapdákkal kombinált elektronspin-rezonancia közelebb visz annak azonosításához. A klasszikus metilénkék-fotokémiai vizsgálatban ESR-rel mutatták ki a festék, az aszkorbát és a fény hatására keletkező aszkorbátgyököt, majd oxigénfelvételi kísérletekkel igazolták a peroxidképződést, spincsapdázásos mérésekkel pedig a vas által katalizált hidroxilgyök-képződést. Mindegyik technika olyan kérdésre válaszolt, amelyre a többi nem tudott: az ESR megadta a gyök azonosságát, az oxigénfelvétel a fluoreszcens szondáktól független reakciófluxust, a kombináció pedig megmutatta, hogy ugyanabban a megvilágított rendszerben szingulett oxigénhez vezető és gyökös reakcióutak is működnek.

Ez az 1984-es eredmény ma is figyelmeztetésként hat. Megvilágítás és redukálószer jelenlétében a festék peroxidot termelt, vas jelenlétében pedig a rendszer hidroxilgyököt, a vizsgált formák közül a legreaktívabbat hozta létre. A szerzők ezt összefüggésbe hozták a szemben jelen lévő aszkorbáttal, és megkérdőjelezték a körültekintés nélküli szemészeti alkalmazást. A mai olvasónak érdemes figyelnie a feltételekre: fény, redukálószer és vas együtt. Ha ezek közül bármelyiket eltávolítjuk, a reakcióút gyengül vagy megszűnik.

Az oxigénelektródok más módon szolgálnak rá a helyükre. A Clark-típusú elektród a nettó oxigénfogyasztást méri, ami igazolja, hogy a festék által hajtott redoxfolyamatok molekuláris oxigént fogyasztanak, és olyan kinetikai adatokat ad, amelyeket semmilyen fluoreszcencia-műtermék nem utánozhat. A terméket azonban nem azonosítja. A peroxid, a szuperoxid és a víz képződése, valamint a szingulett oxigén lecsengése mind oxigénfogyasztással jár. Azonosítás nélkül a fluxus éppoly hiányos információ, mint az azonosítás fluxus nélkül; ezért a megalapozott tanulmányok az elektródot kalibrált peroxidméréssel vagy csapdázással párosítják.

Miért ellentmondásosak az antioxidáns eredmények?

Ha egymás mellé tesszük a három mérési eredményt, a metilénkék szakirodalmának látszólagos ellentmondásai módszertani különbségekre és három biológiai tényre vezethetők vissza.

Először is a festék egyszerre elektronközvetítő és peroxidforrás. Azzal, hogy eltereli az elektronokat a légzési lánc azon helyeiről, ahol az oxigén egyébként szuperoxiddá alakulna, csökkentheti az egyik ROS mennyiségét, miközben redukált formája közvetlenül peroxiddá redukálja az oxigént, növelve egy másikét. A mitokondriális redoxkémiával és a metilénkék megkerülő útvonalként betöltött szerepével foglalkozó laboratóriumnak ezért szondafüggő válaszokra kell számítania: ugyanabban a küvettában a szuperoxidra érzékeny jel csökken, míg a peroxidot jelző érték nő.

Másodszor a peroxid kis dózisban jelzés, nem csupán károsító tényező. A korábbi munkát követő, egéragyi mitokondriumokkal végzett vizsgálat már ötven nanomoláris festékkoncentrációnál peroxidképződést talált, terápiás koncentrációknál mitokondriális DNS-károsodás nélkül, előkezelés után pedig védelmet a rotenon által kiváltott károsodásokkal szemben. A festék csak száz mikromoláris koncentrációnál, jóval a terápiás tartomány felett károsított bizonyos DNS-fragmentumokat, míg a vörös fény és húsz mikromoláris festékkoncentráció együtt olyan szingulett oxigént hozott létre, amely minden vizsgált fragmentumot károsított. A javasolt mechanizmus hormetikus: az enyhe peroxidtermelés Nrf2-höz kapcsolódó antioxidáns védekezést és mitokondriális biogenezist indít be, így a rövid távú prooxidáns mérési eredményt hosszabb távú antioxidáns kimenetel követi. Az egy óra után és az egy nap után leolvasott mérés eredménye eltérhet, mert közben megváltoztak a biológiai folyamatok.

Harmadszor a fény azt is meghatározza, hogy egyáltalán melyik molekula van jelen. A megvilágítás demetilezi a festéket, Azure B és rokon termékek képződésének irányába, és a tenyésztőedény feletti mikroszkóplámpa fénye is elegendő a fotoszenzibilizációhoz. A sötétben és a megvilágítás mellett végzett kísérletek különböző kísérletek, és minden protokoll megvilágítási és festékkezelési kontrollokról szóló részének ennek megfelelően kell kezelnie őket.

Minimális kontrollkészlet és az állítások értelmezése

Az alábbi összehasonlítás a cikk saját referenciaanyaga. Mielőtt bármilyen metilénkékhez kapcsolódó ROS-eredményt elfogadnánk, ellenőrizzük, melyik sort teljesítették a szerzők, és melyiket hagyták ki.

Ebből gyakorlati értelmezési szabály következik. A peroxidázzal végzett, kalibrált és katalázzal ellenőrzött Amplex-mérés a peroxidról ad bizonyítékot. A DCFDA a szonda nem specifikus oxidációjáról ad bizonyítékot, és semmi többről. A gyökfogó kontrollokkal végzett spincsapdázás a gyök azonosságáról ad bizonyítékot. Az oxigénfelvétel a fluxusról ad bizonyítékot. Az a mondat, amely többet állít annál, mint amit a mérési eljárása alátámaszthat, bármilyen magabiztosan fogalmazták is meg, a szondáról szól, nem a festékről. A dózisfüggésről és a hormetikus tartományról, a mitokondriális elektronáramlásról, a festett mintákban fellépő mérési interferenciáról és a mikroszkópos megvilágítás műtermékeiről szóló kapcsolódó tárgyalások tovább bontják ezeket a szempontokat, és mindegyik érvényes marad akkor is, amikor a helykitöltő hivatkozását véglegesre cserélik.