Pofanyálkahártya-sejtek festése metilénkékkel: mit figyeljünk meg

Egy tanuló egy csepp pofanyálkahártya-sejt-szuszpenziót helyez a tárgylemezre, belenéz a mikroszkópba, és szinte semmit sem lát. Néhány halvány, kísértetszerű alak sodródik a világos látótérben. Állít az élességen, majd növeli a megvilágítást, végül arra jut, hogy a tárgylemez üres. A tárgylemez nem üres. A sejtek ott vannak. Szinte átlátszóak, és éppen ez az átlátszóság az a probléma, amelynek megoldására ez a festés szolgál.

Érdemes már a protokoll megkezdése előtt szóba hozni ezt az eltérést a várakozás és a látott kép között. A kezdők azt várják, hogy a mikroszkóp úgy tárja fel a részleteket, ahogyan egy fényképezőgép zoomja láthatóvá tesz egy távoli feliratot. A világos látóterű mikroszkóp ennél szűkebb feladatot lát el: a fényelnyelés különbségeit mutatja meg. Egy festetlen pofanyálkahártya-sejt szinte semennyi fényt nem nyel el, ezért alig hoz létre különbséget. A metilénkék teremti meg ezt a különbséget. A sejten belül egyenetlenül kötődik, és a szerkezetet kontraszttá alakítja. Ha a tanulók megértik ezt az elvet, minden későbbi lépést következményként értelmeznek, nem pusztán egy recept részeként.

Itt hasznos háttérismeret, hogy az egyszerű festések miként növelik a kontrasztot az iskolai laboratóriumban, és a világos látóterű mikroszkóp festés előtti beállításának átismétlése a sikertelen preparátumok felét megelőzheti. A szín kémiai hátterét a metilénkék mikroszkópos használatának bemutatása tárgyalja, amely azt is megmagyarázza, miért kerül ez a festék újra és újra a laborasztalra.

A tanórai protokoll

Az alábbi nedves preparátum az általános tanórai használatra szánt egyszerűbb alapváltozat. Nem igényel lángot vagy fixálási lépést. Egyes felsőoktatási kézikönyvek fixált kenetes változata levegőn szárítást és rövid hőfixálást is tartalmaz, ahogyan a North Central Texas College Biology LibreTexts oldalán közzétett pofanyálkahártya-kenetes gyakorlatában is, de a hőfixálás mikrobiológiai gyakorlat, nem pedig a hámsejtek megfigyelésének feltétele.

Szükséges eszközök és anyagok: tiszta tárgylemezek és fedőlemezek, steril, egyszer használatos mintavevő pálcák (elsősorban ezek ajánlottak) vagy új, lapos fogpiszkálók, cseppentős palackban 0.5–1 százalékos vizes metilénkékoldat, desztillált vagy ionmentesített víz, itatóspapír, kesztyű és 100x, illetve 400x össznagyításra képes összetett fénymikroszkóp.

1. Öblítsük ki a szájat tiszta vízzel. Ez eltávolítja az ételmaradékokat, amelyek később erősen megfestődnének, és elterelnék a figyelmet a sejtekről.
2. Minden tanuló kizárólag a saját pofanyálkahártyájából vegyen mintát. Friss, steril mintavevő pálcával finoman dörzsölje meg az orca belső felszínét. Nyomja hozzá, ne kaparja. Jóval azelőtt hagyja abba, hogy kellemetlen érzés vagy vérzés jelentkezne.
3. A mintavevő pálcát végiggördítve vigyük fel a mintát vékony rétegben egy tiszta tárgylemez közepére. A jól értelmezhető preparátum legfontosabb feltétele a vékony réteg. A vastag, fehér lerakódás festés után értelmezhetetlen kék tömeggé válik.
4. Cseppentsünk egy csepp metilénkéket a kenetre. Hagyjuk rajta 1–3 percig. Számos felsőoktatási protokollban egy perc is elegendő; az NCERT IX. osztályos természettudományos laboratóriumi kézikönyve ideiglenes preparátumhoz körülbelül 3 percet alkalmaz. A hosszabb idő nem jelent jobb eredményt, és a túlfestés a leggyakoribb időzítési hiba.
5. A helyi protokoll szerint óvatosan öblítsük le desztillált vízzel, vagy itatóspapírral szívassuk fel a felesleges festéket. A háttér halványkék legyen, ne mély tengerészkék.
6. A fedőlemezt ferdén engedjük le úgy, hogy először az egyik széle érjen hozzá a preparátumhoz, majd lassan engedjük rá. Így elkerülhetjük a légbuborékokat.
7. A sejtek megkeresését kis nagyításon kezdjük, ellenőrizzük az élességet és a középre igazítást, majd térjünk át 100x, végül 400x nagyításra. 400x nagyításon csak a finom élességállítót használjuk.

A festék koncentrációját érdemes egy mondatban pontosítani. Az iskolai protokollok jellemzően 1 százalékos vizes metilénkékoldatot használnak. A töményebb törzsoldat vagy a hosszabb festési idő gyorsabban sötétíti a hátteret, mint a sejtmagot, így megfordítja azt a kontrasztot, amelyre a gyakorlat épül.

A pofanyálkahártyából vett minta biztonságos kezelése

A pofanyálkahártyából vett minták nyálat és a szájüreg szokásos mikroorganizmusait is tartalmazzák, ezért minden friss kenetet potenciálisan fertőző anyagként kell kezelni, még akkor is, ha a mintát egészséges osztálytársak adják. Az American Society for Microbiology oktatólaboratóriumokra vonatkozó biológiai biztonsági irányelvei rögzítik az általános elveket: a foglalkozás előtt mérjük fel a kockázatot, viseljünk kesztyűt, fröccsenés veszélye esetén védjük a szemet, utána mossunk kezet, fertőtlenítsük a laborasztalokat, és a szennyezett egyszer használatos eszközöket a jóváhagyott biológiai hulladékkezelési eljárás szerint dobjuk ki.

Négy tanórai szabály a legtöbb kockázatot lefedi. Egy mintavevő pálcához és egy tárgylemezhez csak egyetlen mintaadó tartozhat; ezeket soha nem szabad közösen használni. Mindenki csak saját magától vehet mintát, a szomszédjától soha. Az egyszer használatos mintavevő pálcák és fogpiszkálók közvetlenül a kijelölt hulladékgyűjtőbe kerüljenek, soha ne vissza a laborasztalra. Maga a metilénkék megfesti a bőrt és a ruházatot, valamint irritálja a szemet, ezért kesztyűt kell viselni, és be kell tartani a festékek kezelésének szokásos higiéniai szabályait. A gyakorlatot ne terjesszük ki a kenetből származó semmilyen anyag tenyésztésére, és friss emberi mintával ne rögtönözzünk hőfixálást az iskolai biztonsági eljáráson kívül.

Mit figyeljünk meg, és miért így néz ki

100x nagyításon széles, lapos, halványkék sejteket keressünk, szabálytalan ovális vagy sokszögű körvonallal. Egyenként vagy lazán átfedő rétegekben helyezkednek el. Mindegyik sejtben rendszerint egy sötétebb kék folt látható. Ez a folt a sejtmag. Az elrendeződésre is figyeljünk: a laphámsejtek vékony lapocskák, nem gömbök, ezért a széleik inkább repedezett mázra emlékeztetnek, mint kerek léggömbökre.

400x nagyításon három jellegzetesség különül el egyértelműen. A sejthatár a sejtet körülvevő vékony, sötétebb vonalként jelenik meg. A citoplazma világos, egyenletes kék színnel tölti ki a belső teret. A sejtmag sötétebb és tömörebb, gyakran ovális, és többnyire a középpont közelében helyezkedik el, de nem mindig. Kérjük meg a tanulókat, hogy mindhármat rögzítsék, a sejt alakjával és a nagyítással együtt, mert a feladatlap pontosan ezt kéri.

Itt fontos egy pontossági kérdés, amelyet sok feladatlap hibásan kezel. A látható határ a plazmamembrán területének felel meg, de maga a membrán, egy nagyjából 7–10 nanométer vastag lipid kettősréteg, messze az iskolai mikroszkóp felbontóképessége alatt van. A tanulók a sejt optikai szélét és az ott felhalmozódott festéket látják. Ugyanez az óvatosság szükséges a sejtszervecskéknél is. A mitokondriumok, az endoplazmatikus retikulum, a Golgi-készülék és a riboszómák ebben a preparátumban nem láthatók. Jó körülmények között egy hagyományos fénymikroszkóp felbontási határa nagyjából 0.2 mikrométer, ahogyan azt az NCBI mikroszkópos eszközökről szóló sejtbiológiai háttéranyaga ismerteti, és az ultrastruktúra nagy része ennél a határnál kisebb mérettartományba vagy annak közelébe esik. A nagyobb üres nagyítás nagyobbá teszi a képet, de nem ad hozzá részleteket.

Miért a sejtmag festődik a legsötétebbre? A metilénkék kationos festék, oldatban pozitív töltésű, és a sejt negatív töltésű anyagaihoz, mindenekelőtt a nukleinsavakhoz kapcsolódik. A kromatin a sejtmagban koncentrálja a DNS-t, ezért ott halmozódik fel a legtöbb festék. A citoplazma RNS-t és más töltött molekulákat tartalmaz, ezért szintén megfestődik, de szórtabban és halványabban. Fontos pontosítás: a metilénkék nem DNS-specifikus festék. A metilénkék eloszlását a sejtmag képalkotásában vizsgáló kutatás a kation nukleinsavakban gazdag területekhez való kapcsolódását írja le, míg a metilénkék sejtpreparátumokban történő kötődéséről szóló korábbi kvantitatív vizsgálat szerint a kötött festék nagy része nukleinsavakhoz kapcsolódott. A sötét sejtmag és a világos citoplazma tehát kontrasztmintázat, nem molekuláris vizsgálat.

A tanulók várható hibái és azok értelmezése

Szinte minden sikertelen preparátum az öt jellegzetes mintázat valamelyikét mutatja. Tanítsuk meg a tanulókat arra, hogy felismerjék a preparátum hibáját, ahelyett hogy vakon megismételnék az eljárást.

A túlfestés egyformán sötétté teszi a sejteket és a hátteret, így a sejtmag beleolvad a látótérbe. Rövidebb festési idővel vagy alaposabb öblítéssel javítható. Az elégtelen festés halvány, kísértetszerű alakokat hagy, amelyek erősebb megvilágításnál eltűnnek; harminc másodperces lépésekben növeljük a festési időt. A vastag kenetek sűrű, átfedő tömegeket eredményeznek, amelyekben egyetlen körvonal sem követhető; a javítás mechanikai jellegű: legközelebb vékonyabban terítsük szét a mintát, mert egy sejthalmazt semmilyen öblítés nem ment meg. A légbuborékok tökéletes körökként jelennek meg, éles, sötét szegéllyel, és elterelik a kezdők figyelmét, akik sejtszerkezeteknek nézik őket; helyezzük fel újra a fedőlemezt lassan, ferdén. A sejteken vagy körülöttük elszórt apró, sötét pontok rendszerint a szájüreg szokásos baktériumai, ahogyan azt az olyan iskolai protokollok is megjegyzik, mint az Ingrid Science pofanyálkahártya-sejtes eljárása. Jelenlétük igazolja, hogy a szájüregben élőlények élnek, ami emlékezetes lehet a tanulóknak, de ebben a gyakorlatban fajszinten nem azonosíthatók, és nem szabad őket sejtrészként lerajzolni. Az ételmaradékok és a nyálkaszálak szabálytalanul és erősen festődnek; az előzetes szájöblítés ezek csökkentésére szolgál.

Mire nem alkalmas ez a gyakorlat

Ez oktatási célú megfigyelés, nem diagnosztikai vizsgálat. A tanórai festés során látott sejtkép alapján nem diagnosztizálható fertőzés, rák vagy bármilyen betegség, és a cikket nem szabad úgy értelmezni, mintha ennek ellenkezőjét sugallná. A preparátum két nagyításon mutatja meg az alakot, a sejthatárt, a citoplazmát és a sejtmagot. Nem mutatja meg a membrán ultrastruktúráját, a sejtszervecskék részleteit vagy a molekuláris azonosságot. A korlátok egyértelmű kimondása a tudományos pontosságot és a tanulókat is védi: a jó eredmény egy helyesen feliratozott rajz, feltüntetett nagyítással és festékkel, nem pedig az egészségi állapotra vonatkozó következtetés.

Tanulói feladatlap és feliratozott mikrofotók

Az oldalhoz tartozó két segédanyag a fenti feliratozott mikrofotó és az alábbi feladatlap. Nyomtassunk minden tanulónak egy feladatlapot, vagy vetítsük ki, és kérjük meg őket, hogy másolják a kereteket a füzetükbe.

Használata egy 45 perces foglalkozáson: tíz perc a biztonsági tájékoztatóra és a mintavételre, tíz perc a festésre és a preparátum elkészítésére, tizenöt perc a megfigyelésre és a rajzolásra mindkét nagyításon, tíz perc az ellenőrzőlistára és a feliratozott mikrofotóval való összehasonlításra. Az ellenőrzőlista pontjai szándékosan egyszerűen ellenőrizhetők. Vékony kenet, megfelelő festési idő, a citoplazmánál sötétebb sejtmag, feltüntetett nagyítás. Az a tanuló, aki mind a négyet kipipálhatja, megértette azt az elvet, amelynek megtanítására az óra szolgál: a mikroszkópok különbségeket jelenítenek meg, a festékek pedig létrehozzák a megjelenítésre érdemes különbségeket.