Miért használják a metilénkéket saválló festésnél ellenfestékként?

Egy laboratóriumi szakember köpetkenetet vizsgál a teljes festési eljárás után. A kék háttérből vörös pálcák emelkednek ki, és a leletben az szerepel, hogy saválló bacillusok láthatók. Másnap egy másik tárgylemezen egyenletes kék mező látható, vörös pálcák nélkül, és ezt tuberkulózisra negatívként jelentik. E két lelet közül az egyik többet állít annál, mint amit a tárgylemez alátámaszt, és nem az első az.

A félreértés fogalmi eredetű. A szakember a kék festéket a kimutatás kémiai folyamatának részeként kezelte, mintha a metilénkék segítene megtalálni a mikobaktériumokat. Nem segített. Mire a metilénkék a tárgylemezre kerül, maga a vizsgálati próba már lezajlott. A festék csak a hátteret színezi meg, hogy az eredmény leolvasható legyen. Ez a cikk bemutatja a metilénkék célját a saválló festésben, azt, hogy miért éppen kék és nem más színű festéket használnak, valamint hogy milyen következtetést enged meg a kék háttéren megjelenő vörös szín.

A rövid válasz

A saválló festés három alapelvre épülő differenciáló vizsgálat. A karbolfukszint, az elsődleges festéket, minden sejtbe bejuttatják, a viaszos burkú mikobaktériumokba is. A savas alkohol, a színtelenítő szer, eltávolítja a vörös festéket a közönséges sejtekből, a saválló sejtekből azonban nem tudja kivonni. A metilénkék ellenfesték ezután mindent megszínez, amiből a színtelenítő eltávolította a festéket: a nem saválló sejtek, a gazdasejtek és a törmelék kékké válnak, míg a saválló bacillusok vörösek maradnak. Az ellenfestés kontrasztot ad. Semmilyen szerepe nincs abban a kémiai tulajdonságban, amely egy sejtet savállóvá tesz.

Az egyes lépések szerepe

Az alábbi ábra a feladatok megoszlását mutatja. Balról jobbra olvasva az eljárás lépéseit követheti, az alsó sáv pedig arra emlékeztet, hogy az egyes festési módszercsaládok más-más kérdésre adnak választ.

Az első lépés a behatolás. A mikobaktériumok ellenállnak a szokásos vizes festékeknek, mert burkuk szokatlanul hidrofób, ezért a protokoll kényszeríti a festék bejutását. A Ziehl-Neelsen-módszerben a gőzölésig történő melegítés juttatja át a fenoltartalmú karbolfukszint a viaszos sejtfalon. A Kinyoun-féle hideg módszerben a hőt az elsődleges festék jóval töményebb összetétele helyettesíti, és egyes módosított, melegítés nélküli változatok felületaktív anyagokat is alkalmaznak. Az American Society for Microbiology saválló festési protokolljai egymás mellett ismertetik a két összetételt, és a koncentrációkülönbség szembetűnő: a melegítéses módszerben körülbelül 0.3 g bázikus fukszin jut 100 mL-re, míg a hideg módszerben körülbelül 4 g.

A második lépés a differenciálás. A savas alkohol, amely rendszerint 3 mL tömény sósavból és 97 mL 95 százalékos etanolból áll, kimossa a vörös festéket minden olyan sejtből, amelynek fala nem tanúsít különleges ellenállást. Az ép mikobakteriális lipidburokkal rendelkező sejtek megtartják a festéket. Ezen a lépésen múlik az egész módszer, és ez a legérzékenyebb a kivitelezésre, amint azt később részletezzük.

A kontraszt kialakítása az utolsó lépés. A tárgylemezen ekkor vörös saválló sejtek vannak, a festéküket elvesztett sejtek csaknem színtelen hátterében. A 0.3 százalékos w/v metilénkék ismét láthatóvá teszi ezt a hátteret, a vöröstől a lehető legjobban eltérő színnel. Az ellenfestés rövid: a melegítéses módszerben jellemzően 20–30 másodperc, egyes hideg módszerváltozatoknál pedig akár néhány perc. Az időtartam a protokolltól függ, nem a festék önmagában vett tulajdonsága.

Miért ez a festék, és miért kék?

A metilénkék kationos, bázikus festék: színes ionja pozitív töltést hordoz, és a színtelenített baktériumok, gazdasejtek és törmelék negatív töltésű felszíneihez kötődik. Az OpenStax Microbiology ezt a töltésviszonyokon alapuló működést a bázikus festékek általános elveként írja le. A metilénkék azonban kémiailag nem egyedülálló ebben a szerepben. A kristályibolya és a szafranin is bázikus festék. A választás optikai, nem kémiai megfontoláson alapul.

A vörös pálcákhoz kontrasztos árnyalatú háttér szükséges, és a kék a világos látóterű mikroszkópiában különösen jól különül el a vöröstől. A szafranin gyenge ellenfesték lenne, mert a végül kialakuló rózsaszínes-vörös szín túlságosan közel áll a visszamaradt karbolfukszin színéhez, így elmosná éppen azt a különbséget, amelyet az eljárás létrehozott. A kristályibolya sötét ibolyaszínű hátteret adna, amely a vékony vörös bacillusokkal versengene a figyelemért. A legerősebb bizonyíték arra, hogy a feladat a kontraszt megteremtése, nem pedig egy kémiai reakció, a helyettesíthetőség: egyes állatorvosi és módosított protokollok zöld ellenfestékeket, például malachitzöldet és briliánszöldet használnak, és a vizsgálat így is működik, mert bármely egyértelműen eltérő árnyalat ugyanazt a feladatot látja el.

Ebből két gyakorlati következtetés adódik. Először is, a szabványos recept nem ír elő pH-beállítást; ezt az egyszerű, 0.3 százalékos vizes oldatot ne keverjük össze a lúgos készítményekkel, például a Loeffler-féle metilénkékkel, amelyek más festési elven alapulnak. Másodszor, a túlzás káros. A szövettani szakirodalom kifejezetten figyelmeztet arra, hogy a túl intenzív kék háttér elfedheti a kis számban jelen lévő bacillusokat, ezért a tárgylemez protokollban előírtnál hosszabb ellenfestése minden előny nélkül rontja a leolvashatóságot.

A vizsgálatot lehetővé tevő sejtfalkémia

A savas alkohol megkülönböztető hatásának oka a mikobaktériumok burkában rejlik. Ennek szerkezeti magja a mikolil-arabinogalaktán-peptidoglikán komplex: az arabinogalaktánhoz kapcsolódó peptidoglikán, amelynek külső végein nagyon hosszú láncú mikolsavak találhatók. Ezek lipidekben gazdag, szokatlanul kis áteresztőképességű külső mikomembránt alkotnak. A mikobaktériumok külső membránjáról szóló áttekintés részletesen bemutatja ezt a felépítést. A gát mindkét irányban működik. Ellenáll a festék bejutásának, ezért a behatoláshoz hő vagy töményebb elsődleges festék szükséges, és ellenáll a festék kivonásának is, ezért a savas alkohol nem tudja eltávolítani a már bejutott karbolfukszint. A közönséges baktériumoknak nincs ilyen burkuk, ezért elveszítik a festéket. A savállóság tehát leginkább lipidgátból eredő jelenségként érthető meg, nem pedig a fukszin mikolsavhoz való kémiai kötődéseként.

Ez a kémiai háttér egy gyakori rejtélyt is megmagyaráz: a mikobaktériumok a Gram-módszerrel gyengén és kiszámíthatatlanul festődnek, néha halvány, gyöngyfüzérszerű alakokként vagy festetlen árnyékképekként jelennek meg. Hidrofób sejtfaluk korlátozza a kristályibolya behatolását. A saválló festés nem módosított Gram-festés. Más sejfaltulajdonságon alapuló, eltérő differenciálási elvet alkalmaz, ahogyan az egyszerű festés és a Gram-festés összehasonlítása is bemutatja a másik két módszer esetében.

Három módszer, három kérdés

Az egyetlen festéket használó bakteriális módszerek tágabb köréről lásd a mikroszkópos festési atlaszt.

Mit nem bizonyít a vörös szín a kék háttéren?

A vörös pálcák azt jelentik, hogy a mikroorganizmusok a savas alkoholos kezelés során megtartották a karbolfukszint. Ez a megfigyelés összhangban van a Mycobacterium tuberculosis jelenlétével, de a CDC tuberkulózis-diagnosztikai útmutatója kifejezetten megjegyzi, hogy más mikobaktériumok is savállók, ezért a fajazonosításhoz tenyésztés és nukleinsav-vizsgálat szükséges, nem a szín alapján történő következtetés.

A kivitelezési hibák főként a két lemosási lépés körül jelentkeznek. Az elégtelen színtelenítés vörösen hagyja a háttéranyagokat, és álpozitív értékeléshez vezethet. A túlzott színtelenítés eltávolítja a gyengén visszatartott elsődleges festéket, és hozzájárul az álnegatív eredményekhez. A túl intenzív ellenfestés kékbe temeti a kis számban jelen lévő bacillusokat. A vastag kenetek, a kicsapódott reagensek és a szennyezett öblítővíz további műtermékeket okoznak.

Az érzékenységet a mikroorganizmusok mennyisége korlátozza, bármilyen gondos is a kivitelezés. A hagyományos kenetmikroszkópiához nagyjából 5,000–10,000 bacillus szükséges milliliterenként a köpetben, és a CDC korábbi bizonyíték-összefoglalói a kenetvizsgálat érzékenységét körülbelül 45–80 százalékra tették a tenyésztéssel igazolt pulmonális esetek körében. A negatív kenet ezért soha nem zárja ki a tuberkulózist. A CDC jelenlegi útmutatója minden kenetvizsgálat mellett fenntartja a tenyésztés szükségességét, és legalább egy légúti mintán nukleinsav-amplifikációs vizsgálatot javasol, ha felmerül a pulmonális tuberkulózis lehetősége, és az eredmény befolyásolná az ellátást.

A gyakorlati munkát jóváhagyott protokollok szerint kell végezni

Az oktatási célú leírások, köztük ez a cikk, nem jogosítanak fel klinikai munkára. A laboratóriumi gyakorlatban a labor validált standard műveleti eljárását kell követni, összhangban a CDC, az APHL vagy a CLSI aktuális dokumentumaival; a CDC saválló festési referenciaanyaga a Stacks archívumban bemutatja, hogyan határozzák meg ezek az eljárások a reagenseket és az eredmények leolvasását. A tuberkulózis-vizsgálati mintákkal végzett munka zárt, megfelelően védett körülményeket igényel: a keneteket biológiai biztonsági fülkében készítik, mert az előkészítés aeroszolokat és fröccsenést okoz. A CDC laboratóriumi biztonsági útmutatója szerint még a hővel fixált kenetek is tartalmazhatnak életképes tuberkulózisbacillusokat, ezért továbbra is szennyezettként kell kezelni őket. A CDC Public Health Image Library bejegyzése egy M. leprae kimutatására vizsgált, karbolfukszinnal és metilénkékkel festett kenetről jól emlékeztet a módszer tuberkulózison túli alkalmazási körére: ugyanez a kék háttéren megjelenő vörös kontraszt szolgál mindenütt, ahol saválló mikroorganizmusokat keresnek, és a gondosan megállapított negatív lelet önmagában is rögzítésre érdemes eredmény.

A kész tárgylemez leolvasása

Az ellenfestés a kenet átvizsgálásakor bizonyítja hasznosságát. A kis nagyítással pásztázó mikroszkópos vizsgáló először a kék háttér alapján ítéli meg a kenet minőségét: egyenletes-e a sejtek eloszlása, vannak-e ép gazdasejtek az élesség beállításához, és hiányzik-e a nagy mennyiségű csapadék. Ezután a vörös, gyanús képletek éppen azért vonzzák a tekintetet, mert a tárgylemezen semmi más nem vörös. A megerősítés olajimmerzióval történik, amikor a valódi bacillusok a várható vékony, néha enyhén görbült vagy gyöngyfüzérszerű pálcákként látszanak, nem pedig egyöntetű festéktörmelékként.

A háttérfestés a lelet szóhasználatát is meghatározza. A vörös bacillusokat tartalmazó tárgylemezről azt jelentik, hogy saválló bacillusok láthatók, gyakran a laboratórium skálája szerinti félkvantitatív besorolással. A vörös mikroorganizmusokat nem mutató tárgylemezről azt jelentik, hogy saválló bacillusok nem láthatók, soha nem azt, hogy tuberkulózisra negatív. A különbség fontos, mert a kék mező azt igazolja, hogy a festés működött, a sejtek felvették az ellenfestéket, és az optikai feltételek megfelelőek voltak, ugyanakkor semmit nem mond a kimutatási határ alatti mennyiségben jelen lévő mikroorganizmusokról. A vörös képletek nélküli kék mező érvényes eredmény a tárgylemezről, nem ítélet a betegről.

Ha észben tartjuk a feladatok megoszlását, a leletek megfogalmazása magától értetődővé válik. A karbolfukszin jelöli a lehetséges célpontokat. A savas alkohol végzi a próbát. A metilénkék csak leolvashatóvá teszi a választ: a vörös megtartotta a festéket a savval szemben, a kék elveszítette. Minden más — a faj, a mikroorganizmusok mennyisége és a klinikai jelentőség — a tárgylemezen túli vizsgálatokból derül ki.