Metilénkék és nitrogén-monoxid: NOS, cGMP és érjelátvitel

A kérdés egyszerűnek hangzik: gátolja-e a metilénkék a nitrogén-monoxidot? A laboratóriumban a válasz négy külön kérdésre bomlik, és mindegyiket más kísérlettel lehet vizsgálni. Ezek összemosása a fő oka annak, hogy a metilénkékről és a nitrogén-monoxidról szóló írások magabiztosnak, mégis homályosnak hatnak.

A nitrogén-monoxid jelátvitelét képzeljük el négy láncszemből álló láncként. Egy gén átíródik, hogy nitrogén-monoxid-szintáz képződhessen. Az enzim az arginint nitrogén-monoxiddá alakítja. A gáz eldiffundál a célpontjához, mielőtt valami mással reagálna. Az oldható guanilát-cikláz érzékeli, és ciklikus GMP-t termel. A metilénkék hatásáról mindegyik láncszemnél jelentek meg eredmények, de a bizonyítékok eltérő kísérleti rendszerekből, eltérő koncentrációkból és eltérő izoformákból származnak. Az egyik láncszemnél kapott eredmény nem bizonyít hatást egy másiknál.

A szokásos lánc, egyszerűen megfogalmazva

Az érfalban a szokásos folyamat a következő. Egy inger hat az endotélsejtre. Az endoteliális nitrogén-monoxid-szintáz, azaz az eNOS vagy NOS3, rövid ideig kis mennyiségű nitrogén-monoxidot termel. A gáz átdiffundál a szomszédos simaizomsejtbe, kötődik az oldható guanilát-cikláz redukált vasat tartalmazó hemcsoportjához, és felgyorsítja a GTP ciklikus GMP-vé alakulását. A ciklikus GMP aktiválja a protein-kináz G-t, megváltozik a kalcium kezelése a sejtben, és az izom elernyed.

Egy második láncot érdemes ettől elkülönítve kezelni. Fertőzés vagy citokinhatás során a sejtek egy másik enzim génjét írják át: ez az indukálható nitrogén-monoxid-szintáz, azaz az iNOS, más néven NOS2. Ez nagyobb és tartósabb nitrogén-monoxid-áramot hoz létre, mint az eNOS. Egy harmadik izoforma, a neuronális NOS vagy nNOS, megint más összefüggésbe tartozik. Ha egy tanulmány az izoforma megjelölése nélkül említ nitrogén-monoxid-szintázt, álljunk meg, és ellenőrizzük, melyiket mérték. A metilénkék elektronközvetítő működésének áttekintése általában a redoxcélpontokkal kapcsolatban is ugyanezt hangsúlyozza: a közvetítő önmagában semmit sem tesz, és a két végén lévő partner határozza meg az eredményt.

A mért ciklikus GMP szintén összesített jelzőérték, nem közvetlen enzimaktivitási mérés. Szintje a cikláz általi szintézis és a foszfodiészterázok általi lebontás különbségét tükrözi; az érsimaizomban különösen a PDE5 fontos. A ciklikus GMP csökkenése tehát azt jelenti, hogy kevesebb jel jutott el az érzékelőhöz. Önmagában nem árulja el, melyik láncszem mondott csődöt.

1. láncszem: kevesebb iNOS-enzim képződik

Bakteriális lipopoliszachariddal, interferon-gammával vagy mindkettővel stimulált egérmakrofágokban a metilénkék megakadályozta az iNOS-fehérje várt emelkedését, és erősen visszaszorította az iNOS hírvivő RNS-ét a makrofágok transzkripcióját vizsgáló kísérletekben. Az igazán informatív rész az, ami nem változott. Az I kappa B alfa inhibitor lebontása, az NF kappa B és a STAT1 foszforilációja, valamint e faktorok sejtmagba jutása nagyrészt érintetlen maradt. A DNS-hez való kötődésük csökkent, amit kromatin-immunprecipitáció is megerősített: az iNOS promoteréhez kevesebb faktor kötődött.

Ez az enzim mennyiségét megelőző génszabályozási hatás, nem egy már meglévő enzim akut gátlása. A gyulladásos jelátvitelhez tartozik, ahol a transzkripciós faktoroknak a promoterhez kell kötődniük, mielőtt a fehérje megjelenne. A nyugalomban lévő ér konstitutív eNOS-enziméről közvetlenül semmit sem mond, és ennek megfelelően kell leírni.

2. láncszem: a meglévő NOS-enzim lassabban működik

Egy patkányvizsgálat más szintet vizsgált. Éber hím patkányok intravénásan lipopoliszacharidot kaptak, majd három órával később intravénásan vagy fiziológiás sóoldatot, vagy testtömeg-kilogrammonként 3 mg metilénkéket. A mediobazális hipotalamusz nitrogén-monoxid-szintáz-aktivitását a jelölt arginin citrullinná alakulásával mérték a hipotalamikus NOS-aktivitást vizsgáló tanulmányban. Már a stressz és a sóoldat együtt is kiváltott némi kalciumfüggetlen aktivitást, a lipopoliszacharid pedig ezt a kontrollszint körülbelül tízszeresére emelte. A metilénkék mindkét indukált komponenst megszüntette. A kalciumfüggő konstitutív aktivitás ebben a szövetben, ennél a dózisnál és ebben az időpontban nem változott.

Az eredményt pontosan így kell értelmezni: az adott körülmények között csökkent a mért iNOS-típusú aktivitás. Ez nem génexpressziós mérés, és nem bizonyítja, hogy a metilénkék minden körülmények között szelektíven gátolja az iNOS-t az eNOS-szal vagy az nNOS-szal szemben. A tisztított enzimeken végzett vizsgálatok még inkább óvatosságra intenek. Tisztított nitrogén-monoxid-szintáz közvetlen vizsgálatában a metilénkék 30 mikromoláris koncentrációnál teljesen gátolta a citrullinképződést; a félmaximális gátláshoz szükséges koncentráció szuperoxid-diszmutáz nélkül közel 5.3 mikromoláris, annak jelenlétében 9.2 mikromoláris volt, amint azt a tisztított NOS és guanilát-cikláz összehasonlítása közölte. Egy külön, tisztított nNOS-on végzett vizsgálat az enzimhez kötött hem oxidációjának szerepére utalt. A gyakorlati tanulság az, hogy izolált rendszerekben a közvetlen NOS-gátlás valós jelenség, de a hipotalamuszból származó eredményből nem lehet általánosan azt állítani, hogy a metilénkék mindenütt megkímél minden konstitutív NOS-t.

3. láncszem: a nitrogén-monoxid elvész, mielőtt célba érne

A legtisztább bizonyíték arra, hogy a ciklikus GMP csökkenését nem csak enzimgátlás magyarázhatja, tenyésztett nyúl-tüdőartéria-simaizomsejtekből származik. A kísérleti elrendezés teljesen megkerülte az endogén NOS-t: közvetlenül nitrogén-monoxid-donorokat adtak a rendszerhez, majd azt vizsgálták, hogy a metilénkék így is csökkenti-e a ciklikus GMP-választ az érsimaizom szuperoxidját vizsgáló tanulmányban.

Három donort vizsgáltak 1 és 100 mikromoláris koncentráció között: S-nitrozo-L-ciszteint, nátrium-nitroprusszidot és egy MPANO nevű, stabil dezaminált analógot. Mindegyik nagyjából 1.5-szeres és 12-szeres közötti mértékben emelte a ciklikus GMP-t. A metilénkék 10 mikromoláris koncentrációban az első kettő hatását 51 és 100 százalék közötti mértékben gátolta, az MPANO-választ viszont változatlanul hagyta. Ha a metilénkék egyszerűen a cikláz katalitikus helyét gátolná, ezt a donorfüggő szelektivitást nehéz lenne megmagyarázni, mivel mindhárom ugyanarra a későbbi enzimre hat.

Ezután három kontrollvizsgálat a szuperoxidhoz kötötte a mechanizmust. Először: a xantinnal és xantin-oxidázzal létrehozott extracelluláris szuperoxid ugyanezt a mintázatot hozta létre: a CYSNO és a nitroprusszid hatását gátolta, az MPANO-ét megkímélte. Másodszor: a metilénkék dózis- és időfüggő szuperoxid-termelést váltott ki a simaizomsejtekből, amit a citokróm c redukciójával mértek. Harmadszor: a szuperoxid-diszmutáz teljesen megakadályozta a gátlást, a kataláz viszont nem, ami ebben a kísérleti rendszerben a szuperoxidra, nem pedig a hidrogén-peroxidra utal közvetlenül ható kémiai részecskeként.

A kísérlet közös tenyészetben végzett változatát is érdemes ismertetni, mert térben is elhelyezi a hatást. Fedőlemezeken növesztett endotélsejteket rövid ideig simaizomsejtekkel együtt tenyésztettek, így az alapállapotban felszabaduló endoteliális faktor a simaizom ciklikus GMP-jét három–nyolcszorosára emelte. Bármelyik sejtcsoport metilénkékkel végzett előkezelése csökkentette ezt a jelet, a szuperoxid-diszmutáz pedig részben kivédte az endoteliális előkezelés hatását. Más szóval, a metilénkéknek egyáltalán nem kell a jelet érzékelő simaizomsejten belül hatnia. A jelátvivő molekula útközbeni eltávolításával is csökkentheti a jelet. A metilénkék-kutatások értelmezéséhez készült útmutató ezt általános szabályként kezeli: a molekuláris célpont megnevezése előtt nevezzük meg azt a kompartmentet, ahol a beavatkozás történt.

Ezt NOS-gátlásnak nevezni téves lenne. A donorok működéséhez nem volt szükség szintázlépésre, a jel mégis csökkent.

4. láncszem: maga az érzékelő reagál kevésbé

Léteznek közvetlen hatások az oldható guanilát-ciklázra, de a koncentrációk számítanak. A fent idézett, tisztított enzimeket összehasonlító vizsgálatban a nitrogén-monoxiddal stimulált cikláz félmaximális gátlásához körülbelül 60 mikromoláris metilénkék kellett, szemben a NOS közel 5–9 mikromoláris félmaximális gátlási koncentrációjával, és még 1 millimoláris koncentráció is csak részleges maximális gátlást eredményezett. Ez nagyjából hat–tizenegyszeres különbség. Egy alacsony mikromoláris koncentrációval végzett sejtkísérletben megfigyelt ciklikus GMP-csökkenést ezért pusztán a ciklikus GMP értéke alapján nem lehet szelektív ciklázgátlásnak nevezni.

Egy későbbi redoxvizsgálat újabb óvatossági szempontot adott: a metilénkék a nitrogén-monoxiddal aktivált ciklázt a hemvas levegő általi egyszerű oxidációjától eltérő mechanizmussal inaktiválta. Az érzékelő működése tehát károsodhat, de a kémiai háttér még nem tisztázott, és a koncentrációkülönbség miatt alacsony mikromoláris kitettségnél először a szuperoxid- és NOS-hatásokat érdemes kizárni. A foszfodiészterázok kontrollálása is ide tartozik. Ha a lebontást nem mérték vagy nem gátolták, a ciklikus GMP kisebb felhalmozódása egyaránt összeegyeztethető csökkent szintézissel, gyorsabb lebontással vagy mindkettővel.

Miért nem egyszerűsíthető ez egyetlen vérnyomással kapcsolatos állításra?

Mindegyik láncszemet más rendszerben igazolták. A makrofágok transzkripciója nem azonos a hipotalamikus enzimaktivitással. A lipopoliszacharid után mért hipotalamikus aktivitás nem azonos a nyugalmi endoteliális tónussal. A közös tenyészetben alapállapotban felszabaduló endoteliális faktor nem azonos az agonista által kiváltott értágulattal. A 10 mikromoláris metilénkékkel kezelt, tenyésztett tüdőartéria-sejtek nem azonosak az emberi keringéssel. Ha mindezt olyan kijelentésbe sűrítjük, hogy a metilénkék a nitrogén-monoxid gátlásával emeli a vérnyomást, éppen azokat a különbségeket hagyjuk figyelmen kívül, amelyek megőrzésére a kontrollokat kialakították.

Három ellenőrzési szempont teszi pontosabbá az értelmezést. Először nevezzük meg az izoformát: eNOS a nyugalmi értónusnál, iNOS az indukált gyulladásos nitrogén-monoxid-áramnál, nNOS a neuronális és egyes tisztított enzimes vizsgálatoknál. Másodszor nevezzük meg a nitrogén-monoxid-jel forrását: endogén szintézis, alapállapotú endoteliális felszabadulás vagy egy konkrét donor, például CYSNO, nitroprusszid vagy MPANO, hiszen a stabil donor ellenállt a metilénkéknek, a labilisak viszont nem. Harmadszor nevezzük meg a koncentrációt és a hatást kivédő beavatkozást: a szuperoxid-diszmutáz általi kivédés a szuperoxid szerepére utal, a kataláz hatástalansága a hidrogén-peroxid szerepe ellen szól az adott rendszerben, a hatás xantin-oxidázzal történő reprodukálása az elégségességet mutatja, a tisztított enzimekkel végzett vizsgálatok pedig elkülönítik a közvetlen katalitikus hatásokat a jel útközbeni elvesztésétől.

A tömör összegzés a következő. A metilénkéket célszerűbb a nitrogén-monoxid–ciklikus GMP jelátvitelt több ponton módosító ágensként kezelni, mint szelektív ciklázgátlóként. A kísérleti rendszertől és a koncentrációtól függően csökkentheti a transzkripciós faktorok kötődését az iNOS génjénél, közvetlenül gátolhatja a NOS-enzimeket, szuperoxid-képződés révén csökkentheti a nitrogén-monoxid hozzáférhetőségét, és ronthatja a nitrogén-monoxiddal aktivált cikláz működését. A ciklikus GMP-jelátvitel szerepe az érvizsgálatokban és a sejtes vizsgálatokban használt nitrogén-monoxid-donorok összehasonlítása részletesebben tárgyal egy-egy ilyen ágat, a redoxhatások és enzimhatások elkülönítésére használt módszerek pedig megmagyarázzák, miért szerepel olyan gyakran ebben a szakirodalomban a szuperoxid-diszmutáz, a kataláz és egy stabil donorkontroll együtt.

A metilénkék után mért alacsony ciklikus GMP-érték megszakadt láncot jelez. Csak a kontrollok mutatják meg, melyik láncszem szakadt el.