A metilénkék mitokondriális hatásainak mérése: oxigén, ATP és membránpotenciál

Tegyük fel, hogy egy laboratórium metilénkéket ad károsodott légzésű mitokondriumokhoz, és azt látja, hogy nő az oxigénfogyasztás. Kézenfekvő lenne azt írni, hogy a festék helyreállította a mitokondriális működést. Ez az állítás azonban téves lehet. Az oxigénfluxus, az ATP-szintézis és a membránpotenciál három különböző fogalom. Ugyanahhoz a sejtszervecskéhez kötődnek, ahogy a biztonsági mentés, a szinkronizálás és a megosztás ugyanahhoz a felhőbeli mappához: összefüggenek, de más szabályok szerint működnek. Ha összetévesztjük őket, az értelmezés hibás lesz, még akkor is, ha technikailag minden mérés helyes.

A metilénkék esetében különösen könnyű ebbe a hibába esni, mert maga is részt vesz a vizsgált rendszer működésében. Redoxciklusokat végez: elektronokat vesz fel a lánc korábbi pontjain, és ad le a későbbi pontokon. Emellett lipofil kation, amely felhalmozódik az energizált mitokondriumokban, valamint intenzív kék vegyület, amely a gyakran használt szondákkal azonos hullámhossztartományokban nyel el és bocsát ki fényt. Egyetlen mérési eredmény nem elegendő mindezek elkülönítéséhez. A budapesti mitokondriális vizsgálatokban alkalmazott megbízható megközelítés az oxigénfluxus, az ATP-szintézis sebessége, a membránpotenciál és a hidrogén-peroxid-felszabadulás együttes mérése, minden lépésnél festékspecifikus kontrollokkal.

A respirometria az oxigénfluxust méri, nem az energiatermelést

A nagy felbontású respirometria — akár Oroboros Oxygraph, akár Seahorse extracelluláris fluxusanalizátor segítségével végzik — egyetlen dolgot mutat meg: milyen gyorsan redukálódik az oxigén. Nem mutatja meg, hány proton pumpálódott át elektrononként, a gradiens mekkora része maradt fenn, vagy hogy az ATP-szintáz felhasználta-e azt.

A szóhasználat fontos. Izolált mitokondriumokban az ADP nélküli szubsztrátadagolás a szivárgási légzést, a telítő ADP-koncentráció melletti szubsztrátadagolás az oxidatív foszforiláció kapacitását, a szétkapcsolószer titrálása pedig a maximális elektrontranszfer-kapacitást adja meg. Ép sejtekben a megfelelő Seahorse-paraméterek az alaplégzés, az oligomicinérzékeny, ATP-termeléshez kapcsolódó légzés, a protonszivárgás, az FCCP-vel meghatározott maximális légzés, valamint a rotenonnal és antimicinnel szemben rezisztens, nem mitokondriális oxigénfogyasztás. Ha a Seahorse eredményeit State 3 és State 4 állapotként nevezzük meg, olyan pontosságot sugallunk, amelyet a preparátum nem tesz lehetővé, amint azt az Agilent Mito Stress Test értelmezési keretrendszere is világossá teszi.

A metilénkék megszakítja a több oxigén és a több energia közötti intuitív kapcsolatot. Izolált tengerimalac-agyi mitokondriumokban 100 nM és 1 uM közötti festékkoncentráció növelte a nyugalmi oxigénfogyasztást glutamát és malát, szukcinát, valamint alfa-glicerofoszfát szubsztrátok mellett; alfa-glicerofoszfáttal a növekedés nagyjából 64 százalékos volt. Az egészséges mitokondriumok ADP-stimulált légzése ugyanakkor lényegében változatlan maradt az izolált agyi mitokondriumokról szóló vizsgálat szerint. Mivel a szivárgási légzés nőtt, miközben az ADP-stimulált fluxus nem változott, a számított légzéskontroll-hányados csökken. Ez a csökkenés nem azt jelenti, hogy a festék károsította a mitokondriumokat. Azt jelenti, hogy a festék a normál légzéshez hozzáadott egy oxigént fogyasztó redoxciklust. Az a metilénkékes oxigénfogyasztási vizsgálat, amely csak a növekedést közli, valós kémiai folyamatot mért, de semmit nem mondott az energia megőrzéséről.

A helyreállítást vizsgáló kísérletek nagyobb léptékben is ugyanezt az eltérést mutatják. Az I-es komplex blokkolásakor az oxigénfluxus nagyjából háromszorosára emelkedett, miközben az ATP-szintézis csak körülbelül 1.5-szeresére. Több oxigén jutott az elektródhoz, de ennek kisebb hányada járult hozzá az ATP-termeléshez. Az oxidatív foszforiláció javulására vonatkozó bármely állításhoz szükség van az ATP-oldali adatokra is, lehetőleg ATP/oxigén arányként megadva, a nevezőre vonatkozó konvenció feltüntetésével.

Az ATP-vizsgálatok a szintézis sebességét mérik, amelyet az ATP-tartalom nem helyettesíthet

Az ATP-vizsgálat más kérdésre ad választ: mennyi ATP keletkezik egységnyi idő alatt. A kinetikus mérés — akár a szentjánosbogár-luciferáz lumineszcenciájának több percen át tartó követésével, akár egy kapcsolt hexokináz- és glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz-vizsgálattal, 340 nm-en mérve — sebességet ad meg. Az összes ATP egyszeri végpontmérése ezzel szemben ATP-tartalmat ad meg, amely a szintézis és a felhasználás különbségét tükrözi, és önmagában keveset árul el az oxidatív foszforilációról.

A budapesti csoport a kapcsolt enzimatikus módszert alkalmazta, az adenilát-kináz aktivitásának gátlása mellett, és azt találta, hogy 1 és 2 uM közötti metilénkék mérsékelten, de szignifikánsan növelte az ATP-termelést rotenonnal és antimicinnel kezelt mitokondriumokban. Ez valódi, de részleges helyreállítás. A TEGDMA toxicitását vizsgáló tanulmány egy másik modellben hasonló eredményre jutott: 5 mM TEGDMA fogászati monomer az I-es komplexhez kapcsolódó légzést nagyjából 286 fluxusegységről 28-ra csökkentette, míg 2 uM festék körülbelül 86-ra állította vissza.

Színes redoxvegyület esetén két kontroll nélkülözhetetlen. Először oligomicinnel meg kell határozni, hogy a mért ATP-szintézis mekkora része függ az ATP-szintáztól. Másodszor sejtmentes rendszerben ellenőrizni kell az ismert mennyiségben hozzáadott ATP visszanyerését, a teljes reagenskeverékkel és a vizsgálatban használt pontos festékkoncentrációkkal, legalább 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM és 2 uM mellett. A festék elnyelheti a kibocsátott fényt, gátolhatja a jelzőenzimet, vagy megváltoztathatja a reagensek redoxkémiáját; az általános luciferáz-vizsgálati útmutató éppen az ilyen interferenciák miatt ajánl biokémiai ellenőrző vizsgálatokat. Ne feltételezzük, hogy 1 uM mellett nincsenek mérési műtermékek, pusztán azért, mert a kioltás magasabb koncentrációknál általában erősebb.

A membránpotenciál-szondák a festék eloszlását mérik, nem a fluxust

A szafranin O, a TMRM és a TMRE, a rodamin 123, valamint a JC-1 mind membránon átjutó kationok. Az elektrokémiai egyensúlynak megfelelően felhalmozódnak a negatív töltésű mátrixban, így a teljes minta fluoreszcenciája közvetetten, a szonda elhelyezkedésén keresztül jelzi a potenciált. Egyikük sem mér ATP-t vagy elektronfluxust.

Minden szondának megvan a leginkább megfelelő preparátuma. A szafranin O izolált mitokondriumokhoz és permeabilizált sejtekhez alkalmas, jellemzően 2 uM körüli koncentrációban, közel 495 nm-es gerjesztéssel és 585 nm-es emisszióval. Kioltási tartományban működik, ahol a felvétel megváltoztatja a teljes minta fluoreszcenciáját. A TMRM és a TMRE ép sejtekben, alacsony nanomoláris feltöltési koncentrációval, nem kioltásos üzemmódban használható: a depolarizáció hatására a festék távozik, és a mitokondriális fluoreszcencia csökken. Nagy feltöltésnél az önkioltás miatt a jel változásának iránya megfordulhat. A JC-1 kényelmes zöld/vörös arányt ad, de függ a feltöltéstől és a mitokondriális tömegtől, ezért kvantitatív munkára kevésbé alkalmas, mint a gondosan kontrollált TMRM. Ezeket a kompromisszumokat egy széles körben használt, mitokondriális membránpotenciál-szondákról szóló áttekintés foglalja össze.

A metilénkék éppen az alkalmazott koncentrációkban okoz optikai interferenciát. A 600 és 665 nm közötti abszorpciós sávjai átfednek a szondák vörös emissziójával, ezért a belsőszűrő-hatás, a kioltás és a gerjesztőfény elnyelése egyaránt reális lehetőség. A festék emellett egy második lipofil kation, amelynek saját eloszlása a mért potenciállal együtt változik. A védekezés módja a többféle mérés és a vakminták alkalmazása: csak szonda, csak festék, szonda minden festékkoncentrációval, teljes depolarizáció FCCP-vel nulla-referenciaként, és ideális esetben egy második, optikailag eltérő szonda. A III-as komplex megkerülését vizsgáló tanulmány ezt a mintát követte: antimicin- és mixotiazol-gátlás után szafranin O-val és TMRM-mel is megismételte a membránpotenciál helyreállításának mérését, és mindkettővel azonos minőségi helyreállást tapasztalt. Egyetlen optikai jelző támpont. Két független jelző bizonyíték.

Három preparátum, három különböző kérdés

Az izolált mitokondriumok, a permeabilizált sejtek és az ép sejtek nem ugyanazon vizsgálat felcserélhető érzékenységi beállításai. Különböző megközelítések, eltérő működési elvekkel.

Az izolált mitokondriumok megőrzik az elektrontranszportláncot, a belső membránt és a mátrix működéséhez szükséges apparátust, miközben eltávolítják a plazmamembránt, a citoszolt és a hálózati szerkezetet. Éppen ez az eltávolítás a cél: a szubsztrátok, az ADP, a gátlószerek és a festék koncentrációja pontosan meghatározható, így azonosítható az érintett útvonal. Ennek ára a természetes szubsztrátellátás, a jelátvitel és az energiaigény elvesztése.

A permeabilizált sejtek a mitokondriumokat a sejtszerkezet jelentős részén belül tartják, miközben a megnyitott plazmamembránon át beengedik a külső szubsztrátokat és az ADP-t. Megfelelő eszközt jelentenek egy szubsztrátútvonal hibájának azonosítására sejtes környezetben. A túlzott permeabilizálás károsítja a külső membránt, a citoszolikus szabályozás pedig kimosódik.

Az ép sejtek mindent megőriznek: a plazmamembrán gátfunkcióját, a citoszolikus redukálószereket, az endogén szubsztráttranszportot, a mitokondriális hálózatot és az ATP-igényt. Ezek állnak a legközelebb az élettani viszonyokhoz és a legtávolabb a mechanizmus elkülönítésétől, mert a festék felvétele, redukciója és elkülönült megkötése egyaránt alakítja a mitokondriumok tényleges festékexpozícióját.

A TEGDMA-vizsgálat tudatosan használta mindhárom szintet: izolált agyi mitokondriumokat az oxidáció és a potenciál festék általi helyreállításának vizsgálatára; permeabilizált fogpulpa-őssejteket főként annak megállapítására, hogy a károsodás az I-es komplexhez kapcsolódó szubsztrátoxidációt érinti; ép őssejteket pedig annak vizsgálatára, hogy 2 uM festék milyen nettó élettani hatást gyakorol a visszaszorított oxigénfogyasztásra. A különböző preparátumok mitokondriális mérési eredményeit összehasonlító olvasóknak a metilénkék légzési láncon keresztüli elektronátviteléről szóló kísérő magyarázat ad útvonalbeli hátteret, a metilénkékes légzésvizsgálatok értelmezéséről szóló útmutató pedig a koncentrációk és gátlószerek alkalmazásának logikáját tárgyalja.

A redoxaktív festék által megkövetelt kontrollok

Egy redoxciklusokat végző vegyülethez hosszabb kontrolllista kell, mint egy szokványos gátlószerhez, mert a festék önálló kémiai reakciói biológiai folyamatokat utánozhatnak.

Respirometriánál használjunk csak puffert tartalmazó kamrát a jel sodródásának mérésére, puffert és festéket tartalmazó kamrát biológiai anyag nélkül, festéket a vizsgálatban jelen lévő bármely extracelluláris redukálószerrel, valamint a mérés végén rotenont és antimicint az ép sejtek nem mitokondriális oxigénfogyasztásának meghatározására. Fontos, hogy a redukált festék az oxigénnek történő elektronátadással oxidálódik vissza, miközben hidrogén-peroxid képződik. Ezért az elektrondonor nélküli, csak festéket tartalmazó vakminta alábecsüli azt a sejtmentes oxigénfogyasztást, amely NADH vagy NADPH jelenlétében jelentkezik.

Hidrogén-peroxid mérésére a nem szelektív DCFDA-festékek helyett részesítsük előnyben a kalibrált Amplex UltraRed és tormaperoxidáz kombinációját, ellenőrizzük az eredményt katalázzal, és vizsgáljuk meg a megvilágítástól való függést, mivel a festék fotoszenzibilizátor. Az agyi mitokondriumok vizsgálata szerint a peroxidterhelés már 100 nM festéknél több mint négyszeresére nőtt, miközben az eltávolítás lassult; a peroxid közvetlenül a redukált festékből képződött, szuperoxid-köztitermék nélkül. A szondaválasztás és a fénykontrollok részleteit a reaktív oxigénformák festékkísérletekben történő méréséről szóló kísérő cikk tárgyalja. Azt a tágabb kérdést pedig, hogy a peroxid mikor működik jelként, és mikor jelent terhelést, a sejtek redoxegyensúlyáról és az antioxidáns hatásra vonatkozó állításokról szóló cikk ismerteti.

Az útvonalakra vonatkozó állításokhoz vizsgáljuk a III-as komplex mindkét gátlási helyét: antimicin A-val a Qi-helyet, mixotiazollal a Qo-helyet, továbbá cianiddal a IV-es komplexet mint végpontot. Egy korábbi, egéragyon végzett vizsgálat szerint a festék helyreállította a rotenonnal blokkolt légzést, az antimicinnel blokkoltat viszont nem. A későbbi, három fajt vizsgáló tanulmány mindkét gátlószer mellett részleges helyreállást talált, és bizonyítékot mutatott a citokróm c közvetlen redukciójára. A megkerülő útvonalat az újabb adatokkal összeegyeztethető lehetőségként kezeljük, ne lezárt kérdésként, mivel a festékkoncentráció, a gátlási hely, a szubsztrátállapot és a festék eloszlása egyaránt módosítja a megfigyelt útvonalat.

Vizsgálatválasztási mátrix

E táblázat segítségével a kérdéshez válasszuk a mérést, ne fordítva.

Egy minimálisan meggyőző állításhoz ugyanazokat a festékkoncentrációkat — 100 nM, 300 nM, 1 uM és 2 uM — kell alkalmazni az oxigénfluxus mérésében szivárgási légzés, ADP, oligomicin és szétkapcsolószer mellett, az ATP-szintézis sebességének mérésében, a membránpotenciál lehetőleg két szondával történő mérésében, valamint a kalibrált peroxidfelszabadulás mérésében katalázos és sejtmentes kontrollokkal. Az összekapcsolt adatsort közöljük: oxigénfluxus, ATP-szintézissebesség, ATP/oxigén arány, potenciál és peroxid. E számok bármelyike önmagában csupán egy mérés, amely még értelmezésre vár.