Metilénkék és fényexpozíció: hullámhossz, besugárzási teljesítménysűrűség és kezelési geometria

Két tanulmány arról számol be, hogy a metilénkéket négyzetcentiméterenként 10 J fényenergiának tették ki. Az egyikben ez elpusztítja a baktériumokat. A másikban nincs mérhető hatása. Ha az olvasó csak a dózist hasonlítja össze, arra jut, hogy a kutatási terület következetlen. A terület következetes. A dózis soha nem írta le a teljes expozíciót.

A fényexpozíció együtt ható paraméterek kis rendszere: a hullámhossz, a besugárzási teljesítménysűrűség, az időtartam, az ezekből adódó fluencia, az oxigén hozzáférhetősége, a festék koncentrációja és aggregációs állapota, a festék alkalmazása és a megvilágítás közötti idő, valamint az az optikai út, amelyet a fény ténylegesen megtesz a mintában. Ha az egyik változik, a fotokémia is megváltozik. Ez a cikk sorra veszi a paramétereket, majd elkülöníti a közeli infravörös fotobiomodulációt a festék közvetlen fotoaktiválásától, mert ezt a két működésmódot keverik össze a leggyakrabban.

A hullámhossz dönti el, hogy a festék részt vesz-e a folyamatban

A vízben oldott metilénkék monomerként erősen elnyeli a vörös fényt: abszorpciós maximuma 664 és 665 nm közelében van, a rövidebb hullámhosszak felőli oldalon pedig 610 nm körül egy váll jelenik meg, amely erősödik, ahogy a festék dimerekké és nagyobb molekulahalmazokká aggregálódik. A maximum közelében a moláris extinkciós együttható nagyságrendje 65,000 és 85,000 M-1 cm-1 közötti, így már a mikromoláris oldatok is intenzíven kékek. A metilénkék DNS-sel és biológiai szubsztrátokkal kapcsolatos fotokémiájának korai áttekintése dokumentálja ezt az abszorpciós viselkedést és az azt követő gerjesztettállapot-kémiát: az abszorpció rövid élettartamú szingulett állapotot hoz létre, amelyből hosszabb élettartamú triplett állapotba történik átmenet, a közölt hozamok szerint körülbelül 0.5 értékkel; levegőztetett oldatban ezt az állapotot az oxigén körülbelül 2 mikroszekundum alatt kioltja.

Ennél a kioltási lépésnél válik szét a két fotokémiai út. A II. típusú fotokémiában a triplett állapotú festék energiát ad át az alapállapotú oxigénnek, és szingulett oxigént hoz létre; a gyakran idézett hozamok körülbelül 0.52 értékűek. Az I. típusú fotokémiában a triplett állapot ehelyett elektront vagy hidrogént ad át egy szubsztrátnak, így gyökök, köztük szuperoxid- és hidroxilgyökök keletkeznek. Mindkét út egyszerre is működhet, és a hagyományos fotodinamikus hatás akkor is erősen oxigénfüggő marad, ha az I. típusú út is hozzájárul.

A metilénkékhez alkalmazott hullámhossz kiválasztására ebből egyszerű szabály következik. A körülbelül 630 és 680 nm közötti vörös fény átfed a festék abszorpciós sávjával, a 660 és 665 nm közötti tartomány pedig a monomer maximumának közelében van, ezért mindenütt képes fényérzékenyítő által közvetített fotokémiát kiváltani, ahol számottevő mennyiségű festék van jelen. A 810 nm-es közeli infravörös fény jóval az alapállapoti abszorpciós sávon kívül esik, ezért ez a hullámhossz nem alkalmas a festék hatékony közvetlen gerjesztésére. A koncentráció egy lényeges módon árnyalja a képet: növekedésével a festék egyre nagyobb része van jelen dimer és aggregált formában, amelyek inkább 610 nm felé nyelnek el, és molekulánként kevésbé hatékony fényérzékenyítők, ezért a festék mennyiségének megduplázása nem kétszerezi meg a hatást. A metilénkékről és a vörösfény-terápiáról szóló kapcsolódó áttekintés ezt az abszorpciós szabályt minden fényérzékenyített reakció előfeltételeként kezeli.

A besugárzási teljesítménysűrűség, az időtartam és a fluencia három paraméter, nem egy

A négyzetcentiméterenként J-ban megadott fluencia a besugárzási teljesítménysűrűség és az idő szorzata. Ha csak a fluenciát közlik, rejtve marad, milyen ütemben érkezett az energia, pedig ez az ütem számít.

A rövid ideig alkalmazott nagy besugárzási teljesítménysűrűség és a hosszú ideig alkalmazott kis besugárzási teljesítménysűrűség ugyanazt a fluenciát adhatja, miközben eltérő fotokémiát eredményez. A nagy besugárzási teljesítménysűrűség gyorsabban fogyasztja az oldott oxigént, mint ahogy a diffúzió pótolni tudja, így az expozíció során visszafogja az oxigénfüggő II. típusú út működését. Hőt is juttat a mintába, a szövet pedig a felmelegedésre a véráramlás változásával reagál, ami az oxigénellátottságot és a festék eloszlását egyaránt módosítja. A hosszú expozíció során alkalmazott kis besugárzási teljesítménysűrűség fenntartja az oxigén utánpótlását, ugyanakkor időt ad a helyreállítási és újraoxigenizációs folyamatoknak arra, hogy már az expozíció alatt működjenek. A fotokémiai tankönyvek reciprocitásnak nevezik azt a feltételezést, hogy csak az összdózis számít. Ez nem érvényes, ha az oxigén, a felmelegedés vagy a biológiai folyamatok is szerepet játszanak, ami szövetben szinte mindig így van.

A metilénkékkel végzett humán antimikrobiális fotodinamikus expozíciók során gyakran négyzetcentiméterenként 6 és 18 J közötti értékeket alkalmaznak, amelyek átfednek a fotobiomodulációs értékekkel. A fluencia önmagában ezért nem azonosítja a működésmódot. A festéket tartalmazó szövetet 660 nm-en érő, négyzetcentiméterenként 10 J expozíció fényérzékenyítő által közvetített fotokémia. Ugyanez a fluencia 810 nm-en, nyomnyi festéket tartalmazó szövetben egészen más folyamat. A szám egyezik. A fogalom eltér.

Az optikai úthossz és a minta geometriája dönti el, mivel találkozik a fény

A Beer–Lambert-törvény szerinti viselkedés azt jelenti, hogy a minta elülső részét jóval több fény éri, mint a hátulsót. Több tíz mikromoláris festéket tartalmazó küvettában az első milliméter elnyelheti a beeső vörös fény nagy részét, így a mélyebb rétegek gyakorlatilag nem kapnak fényexpozíciót. Ha ugyanebből az oldatból kis térfogatot helyezünk egy sekély mérőüregbe, az expozíció közel egyenletessé válik. Ugyanaz a festék, ugyanaz a lámpa, ugyanaz a felületi fluencia, mégis más eredmény.

A szövetben az abszorpcióhoz szóródás is társul. A 660 nm körüli vörös fény milliméteres nagyságrendű mélységbe hatol; a pontos mélységet a vértartalom, a pigmentáció és a szövettípus határozza meg. A mérőüregek saját műtermékeket is létrehoznak: a meniszkusz lencsehatását, a falakról való visszaverődést, a szélső üregek árnyékolását és a fényforrás alatti kis térfogatok felmelegedését. Két laboratórium, amely azonos lámpabeállításokat közöl, de eltérő lemeztípust, térfogatot vagy fényforrás-távolságot használ, eltérő kísérletet végzett.

A távolságot külön ki kell emelni, mert ez a leggyakoribb rejtett változó. Nem kollimált fényforrás esetén a besugárzási teljesítménysűrűség gyorsan csökken a távolsággal, így ha a lámpát a lemez fölött 2 cm-ről 5 cm-re emelik, a besugárzási teljesítménysűrűség többszörösen is csökkenhet, miközben a módszertani leírás változatlan marad. A minta felületén mért besugárzási teljesítménysűrűség nélkül a gyártó teljesítményadataiból számolt, publikált fluenciák becslések, nem mérések.

Magyarázatokkal ellátott paraméterútmutató: mitől lesz reprodukálható az expozíció?

Az oldal eredeti szemléltető anyaga egy ellenőrzőlista. Ha egy vizsgálat fényexpozíciójának leírásából ezek az adatok hiányoznak, nem hasonlítható össze egy másikkal, bármennyire hasonlónak tűnik is a kiemelt dózis.

1. Hullámhossz és sávszélesség. A maximum és a teljes szélesség, nem egy szín megnevezése. A vörös LED 630 és 680 nm közötti tartományt fed le, amelyen belül a festék abszorpciója jelentősen eltér.
2. A minta felületén mért besugárzási teljesítménysűrűség, négyzetcentiméterenként mW-ban. A gyártó által megadott teljesítmény nem besugárzási teljesítménysűrűség.
3. Időtartam és impulzusüzem. Folyamatos vagy impulzusos megvilágítás, adott esetben az impulzusfrekvenciával és a kitöltési tényezővel együtt.
4. A fent megadott, mért értékpárból számított fluencia, négyzetcentiméterenként J-ban.
5. A festék koncentrációja, formulációja és aggregációs állapota. A 664 nm körüli monomer másképp működik fényérzékenyítőként, mint a 610 nm körüli aggregátumok.
6. Gyógyszer–fény időköz. A festék beadása és a besugárzás közötti, percektől órákig terjedő idő, amely meghatározza, hol van a festék a fény érkezésekor.
7. Oxigénellátottság. A levegőztetett oldat és a hipoxiás szövet közötti különbség közvetlenül módosítja az I. és II. típusú utak egyensúlyát.
8. Geometria. A minta mélysége és térfogata, az edény típusa, a fényforrás távolsága és szöge, valamint a megcélzott szöveti réteg mélysége.

Hasznos szokás a tanulmányok olvasásakor: először a gyógyszer–fény időközt ellenőrizzük. Ez megmutatja a szándékot. A fotodinamikus vizsgálati elrendezésekben szándékosan a festéket tartalmazó szövetet sugározzák be. A kombinációs elrendezésekben szándékosan elkülöníthetik a kettőt, ahogy az alábbiakban is látható.

A közeli infravörös fotobiomoduláció nem a festék fotoaktiválása

A fotobiomoduláció, szokásos rövidítésével PBM, vörös vagy közeli infravörös fénnyel módosítja az endogén jelátvitelt, hozzáadott fényérzékenyítő nélkül. A fotodinamikus terápia, szokásos rövidítésével PDT, három összetevőt használ együtt: a fényérzékenyítő által elnyelt fényt, magát a fényérzékenyítőt és az oxigént, hogy a célpontot károsító reaktív részecskék intenzív képződését váltsa ki. A mitokondriumokat neuroprotekciós célpontként tárgyaló áttekintés azért kapcsolja össze a metilénkéket a PBM-mel, mert különböző irányokból hatnak a sejtlégzésre: a festék katalitikus redoxciklust működtetve támogatja az elektronáramlást, míg a feltételezés szerint a PBM elősegíti a gátló hatású nitrogén-monoxid leválását a IV. komplex citokróm-c-oxidáz enziméről. Ezt az enzimmechanizmust továbbra is hipotézisként kell megjelölni.

A két legtöbbet idézett kombinációs egérvizsgálat egyaránt 810 nm-es fényt használ, és éppen ezért nem bizonyítja a festék fotoaktiválását. Egy alvásmegvonás előtti előkezelést vizsgáló tanulmányban az egerek a megvonás előtt naponta 0.5 mg/kg metilénkéket, kétnaponta 810 nm-es impulzusos lézerkezelést vagy mindkettőt kapták. A kombinált előkezelés megóvta a memóriához kapcsolódó viselkedést és a hippokampusz szinaptikus fehérjéit, míg az önálló kezelések nagyrészt eredménytelenek voltak. Egy krónikus stresszt és párhuzamos kezelést vizsgáló tanulmányban az egerek 810 nm-es PBM-et kaptak négyzetcentiméterenként 8 J fluenciával, a naponta adott 0.5 mg/kg festék mellett; először a lézert alkalmazták, majd két órával később injektálták a festéket, kifejezetten azért, hogy elkerüljék a festéket tartalmazó szövet besugárzását. Mindhárom kezelési ág visszafordította a tanulási hiányosságokat, az additív előny pedig főként a szérumkortizol és az agyi reaktív oxigénformák tekintetében jelentkezett. Ezek az eredmények két, együtt alkalmazott mitokondriális beavatkozást tesztelnek; ezt a különbséget a fotodinamikus vizsgálatok gyűjteménye azzal teszi láthatóvá, hogy indikációnként rögzíti a hullámhosszt.

A bőrrel kapcsolatos bizonyítékok a másik oldalra tartoznak. A metilénkéket fénnyel kombináló humán bőrvizsgálatok adatai a 630 és 680 nm közötti tartományban csoportosulnak, helyileg vagy a lézióba adott festékkel, roncsolási vagy szöveti átépülést célzó szándékkal, ami definíció szerint PDT. Ha az így elért elváltozás-megszűnést annak bizonyítékaként idézik, hogy a festék fokozza a PBM-et, vagy egy 810 nm-es egérvizsgálatban tapasztalt helyreállítást annak bizonyítékaként, hogy egy 660 nm-es panel és festék együtt kognitív protokollt alkot, összekeverik a működésmódokat. Az adagolási és farmakológiai referenciaanyag, valamint a biztonsági és kölcsönhatási útmutató részletesebben tárgyalja a koncentrációval és az ellenjavallatokkal kapcsolatos kérdéseket.

A számok összehasonlítása előtt nevezzük meg a fogalmat. A hullámhossz határozza meg, hogy a festék elnyeli-e a fényt. A besugárzási teljesítménysűrűség és az időtartam határozza meg, mit kezd a fotokémia ezzel az elnyeléssel. A geometria határozza meg, a minta mely része tapasztalja meg mindezt. Két expozíció, amely egy paraméterben egyezik, a többiben viszont eltér, különböző kísérletet jelent; ez az útmutató éppen azt a hibát hivatott megelőzni, hogy felcserélhetőként kezeljük őket. Mindebből nem következik otthoni protokoll; a festék abszorpciójával kompatibilis hullámhosszú fény és a szisztémásan alkalmazott festék az egyébként moduláló expozíciót fényérzékenyítő által közvetített fotokémiává alakítja, amely klinikai szakemberek kezébe való.