Egyszerű metilénkék-festés és Gram-festés: mit bizonyíthatnak az egyes módszerek

Egy hallgató kenetet készít egy E. coli feliratú tenyészetből, egy percre elárasztja metilénkékkel, leöblíti, majd olajimmerziós objektívvel megvizsgálja. Kék pálcák borítják a látóteret. A laboratóriumi jegyzőkönyvben ez áll: „E. coli-ként azonosított Gram-negatív pálcák.” A megfigyelés helyes. A következtetést azonban ez a tárgylemez nem támasztja alá.

A hiba fogalmi, nem technikai. A hallgató úgy kezelte az egyszerű festést, mintha differenciáló vizsgálat lenne. Az egyszerű festés és a Gram-festés különböző kérdésekre válaszol, mert eltérő festési elveken alapul. Az egyik azt kérdezi: milyen alak látható? A másik azt: hogyan viselkedik a sejtfal a próba során? Ha összekeverjük a kettőt, egy helyesen megfestett tárgylemezből megalapozatlan jegyzőkönyv születik.

Ez az összehasonlítás külön kezeli a két módszert, megmutatja, milyen állításokat enged meg az egyes eredmények alapján, és megválaszolja a hallgatók két leggyakoribb kérdését: használható-e metilénkék a Gram-festésben, és mit mutat valójában az E. coli metilénkék-festése?

A rövid válasz

Az egyszerű metilénkék-festés minden festhető sejtet ugyanolyan kékre színez, így megmutatja a morfológiát (pálcák, gömbök, spirálok) és az elrendeződést (egyesével, párokban, láncokban), de semmit sem árul el a Gram-besorolásról. A Gram-festés jóddal, egy színtelenítési lépéssel és ellenfestéssel egészül ki, így a baktériumokat Gram-pozitív (lila) és Gram-negatív (rózsaszín vagy vörös) csoportokra választja szét az alapján, hogy sejtburkuk hogyan tartja meg a festéket. A metilénkék-festés után látható kék pálcák jelentése: „pálca alakú sejtek vannak jelen”. A teljes Gram-festési eljárás után látható rózsaszín pálcák jelentése: „Gram-negatív pálcák vannak jelen”. A második állítás erősebb, mert az eljárás egy további próbát is tartalmazott.

Az egyetlen festéket használó baktériumfestési módszerek tágabb köréről, amelyhez ez a cikk is tartozik, lásd a mikroszkópos festési atlaszt.

Egyszerű festés: egy festék, egy kérdés

A metilénkék bázikus (kationos) festék. Színes ionja pozitív töltésű, és a sejt negatív töltésű struktúráihoz kötődik, köztük a nukleinsavakhoz és a savas felületi csoportokhoz, ezért a sejtek kéknek látszanak a halvány háttér előtt. Az OpenStax a festésről szóló fejezetében ismerteti a pozitív festés ezen elvét. Maga a festékkation az a kis méretű, lapos fenotiazinion, amelyet a metilénkék kémiájáról szóló ismertető részletez; a klorid ellenion nem vesz részt a színezésben.

A szokásos oktatási protokoll szándékosan egyszerű: készítsünk vékony kenetet, hagyjuk levegőn megszáradni, hővel rögzítsük, árasszuk el körülbelül 1%-os vizes metilénkékoldattal nagyjából egy percre, óvatosan öblítsük le vízzel, itassuk szárazra, majd vizsgáljuk olajimmerzióval. A LibreTexts egyik oktatási protokollja pontosan ezt az 1%-os, egyperces változatot írja le, megjegyezve, hogy egyes laboratóriumok hosszabb időt alkalmaznak. Nincs festékpác, nincs színtelenítő, nincs második festék. Éppen ez a hiány a lényeg. Egyetlen festékkel, szelektív eltávolítás nélkül minden festéket megkötő sejt ugyanolyan színű lesz.

E. coli esetében a várható látótérben kék pálcák (bacillusok) láthatók, egyesével, párokban vagy kisebb csoportokban. A kék színt a festék adja. A pálcaalak a mikroorganizmus sajátossága. A kettő együtt azonban nem azonosítja a mikroorganizmust, mert sok faj pálca alakú, és sokféle pálca festődik kékre egyszerű festéssel. Az ATCC mikrobiológiai tenyésztési útmutatója egyértelműen kimondja, hogy ez a módszer csak morfológiai információt ad. A helyes jegyzőkönyvi megfogalmazás: „kék bacillusok figyelhetők meg”. Az alakon és az elrendeződésen túl minden állításhoz további bizonyíték szükséges.

Gram-festés: négy reagens, egy viselkedési próba

A Gram-festés differenciáló festés. Minden sejtet ugyanannak a lépéssornak vet alá, és azt vizsgálja, mely sejtek tartják meg az első festéket, és melyek veszítik el. Az American Society for Microbiology Gram-festési protokolljai meghatározzák a szokásos négylépéses sorrendet: kristályibolya (elsődleges festék), Gram-jód (festékpác), alkohol vagy aceton-alkohol (színtelenítő), majd szafranin (ellenfesték).

A szokásos oktatási modell a sejtburkok szerkezetével magyarázza az elkülönülést. A Gram-pozitív sejtek vastag peptidoglikán sejtfala az alkoholos mosás során dehidratálódik, és megtartja a kristályibolya–jód komplexet. A Gram-negatív sejteknek vékony peptidoglikánrétegük és lipidekben gazdag külső membránjuk van, amelyet a színtelenítő megbont, így a komplex kimosódik, és a sejtek ezután felveszik a szafranint. Az NCBI Bookshelf Gram-festésről szóló áttekintése ezt a sejtfalon alapuló magyarázatot ismerteti. A szakemberek hozzáteszik, hogy a teljes fizikai-kémiai háttér összetettebb annál, mint amit a falvastagság önmagában megmagyaráz, de a laboratóriumi értelmezésben a viselkedési szabály érvényes: a lila a festék megtartását jelenti, a rózsaszín pedig annak elvesztését, majd az ellenfestést.

Szemléltető ábrák. Stilizált rajzok a módszerek összehasonlítására, nem kamerával készült mikroszkópos felvételek. A színek leegyszerűsítve mutatják az elvet: egy szín az egyszerű festésben, két szín a Gram-festés színtelenítési lépése után.

Használható-e metilénkék a Gram-festésben

Ennek a kérdésnek két értelmezése van, és ezekre eltérő választ kell adni.

Az első értelmezés: helyettesítheti-e a metilénkékkel való egyszeri elárasztás a teljes Gram-festési lépéssort? Nem. Jód, színtelenítő és ellenfesték nélkül nincs differenciáló lépés, így a Gram-besorolást sem vizsgáljuk. A kizárólag metilénkékkel végzett festés után látható kék látótér egyszerű festés eredménye, még akkor is, ha a palack a Gram-festés reagensei mellett áll. Ne jegyezzük fel Gram-festési eredményként.

A második értelmezés: helyettesítheti-e a metilénkék a szafranint ellenfestékként a 4. lépésben? Funkcióját tekintve képes megszínezni a színtelenített sejteket, és egy tankönyvi feladat ilyen csere után lila Gram-pozitív és kék Gram-negatív sejteket jósol. Az elgondolás helyes, mert a megfelelően színtelenített Gram-negatív sejtek szinte színtelenek, és felvesznek egy másik kationos festéket. Ez azonban nem a szabványos protokoll. Az ASM protokolljai szafranint írnak elő, egyes változatokban olyan elfogadott alternatívákkal, mint a bázikus fukszin, de nem a metilénkék. Gyakorlati hátránya is van: a kéket nehezebb megkülönböztetni a lilától, mint a rózsaszínt a lilától, különösen kezdőknek és különösen elöregedett mikroszkóplámpák fényénél. Oktatási munkában és minden olyan eredménynél, amelynek jelentősége van, a protokollban megnevezett ellenfestéket használjuk, általában szafranint, és a metilénkékes ellenfestést szemléltető változatként kezeljük, ne egyenértékű szabványos eljárásként.

Azt a kapcsolódó kérdést, hogy a metilénkék hogyan viszonyul más, egyetlen festéket használó lehetőségekhez, az egyszerű baktériumfestések összehasonlítása tárgyalja.

Mit bizonyít az E. coli metilénkék-festése, és mit nem

Az E. coli Gram-negatív pálca, de ez a mondat több módszerből származó tényeket egyesít: a morfológiát mikroszkópos vizsgálatból, a Gram-reakciót Gram-festésből, az azonosságot pedig tenyésztésből és biokémiai vagy molekuláris vizsgálatokból ismerjük. Egy metilénkékkel festett kenet csak az első részhez járul hozzá. Megállapítja, hogy a festett mintában pálca alakú sejtek vannak jelen, és megmutatja az elrendeződésüket. A Gram-reakciót nem állapítja meg, mert nem történt színtelenítési próba. A fajt sem azonosítja, mert sok faj pálcái egyformának látszanak ezen a felbontáson.

Itt romlanak el a jegyzőkönyvek, mégpedig kiszámítható módon. A szerző háttérismeretet („ennek a tenyészetnek E. coli-nak kellene lennie, az E. coli pedig Gram-negatív”) emel be a megfigyelés leírásába, így a tárgylemez látszólag megerősíti azt, amit valójában csak feltételeztek. Egy pontosabb jegyzőkönyv elkülöníti ezeket a szinteket: „Egyszerű metilénkék-festés: kék bacillusok figyelhetők meg; csak morfológiai megfigyelés, a Gram-besorolás vizsgálata nem történt meg.” Ezután, ha a Gram-festést helyesen, kontrollokkal végezték el: „Gram-festés: rózsaszín pálcák, ami Gram-negatív reakciónak felel meg.” A faj azonosítása később, az azonosítási munkafolyamatból következik, nem pusztán a színből.

Gyakorlati értelmezési útmutató

A laboratóriumi munkában alkalmazzuk ezt a döntési szabályt. Ha minden sejt egyforma színű, és a protokoll egyetlen festéket használt színtelenítő nélkül, akkor egyszerű festést végeztünk. Rögzítsük az alakot, a becsült méretet és az elrendeződést. Ennél ne menjünk tovább. Ha a protokoll kristályibolyát, jódot, színtelenítőt és ellenfestéket alkalmazott ismert pozitív és negatív kontrollokkal, akkor Gram-festést végeztünk. Rögzítsük a színt és a morfológiát: lila coccusok láncokban, rózsaszín pálcák és így tovább.

A legtöbb félreértés három hibára vezethető vissza. Az első, hogy a kék pálcák látványát túlértelmezik az E. coli jelenlétének megerősítéseként. A második, hogy a metilénkékkel festett tárgylemez eredményét a jegyzetfüzet „Gram-festés” címszava alatt rögzítik, amit a későbbi olvasók félreértenek. A harmadik, hogy meggondolatlanul cserélgetik az ellenfestékeket, majd úgy hasonlítják össze a különböző laboratóriumokban kapott színeket, mintha azonos színskálát használnának. Mindhárom hiba ugyanúgy javítható: nevezzük meg a ténylegesen elvégzett módszert, és csak azt állítsuk, amit az a módszer vizsgál.

Az egyszerű festés éppen azért értékes, mert kevés állítást tesz lehetővé. Gyors, kevésbé érzékeny a kisebb kivitelezési eltérésekre, és elegendő, ha a kérdés a morfológiára vonatkozik: van-e ott valami, és milyen alakú? Ha a kérdés a besorolás, végezzük el a differenciáló vizsgálatot. A kék tárgylemez megmutatja, hogyan néznek ki a sejtek. A lila vagy rózsaszín tárgylemez megmutatja, hogyan viselkedik a sejtfaluk. Önmagában egyik tárgylemez sem árulja el a fajt.