A Loeffler-féle lúgos és a polikróm metilénkék-festések magyarázata

Három üveg állhat egymás mellett a festőasztalon, mindegyiken a metilénkék valamelyik változatának nevével. Az egyiken 1%-os vizes metilénkék szerepel. A másikon Loeffler-féle lúgos metilénkék. A harmadikon polikróm metilénkék. A siető munkatárs a legközelebbiért nyúl. A kenet ezután túl halványan, túl egyenletesen kékre vagy váratlan lila árnyalatokra festődik, és az eredményért a mintát hibáztatják.

Ez az összetétel problémája, nem a mintáé. A három oldat rokon festékanyagokat tartalmaz, de eltérő festési elveket képvisel. Az egyik egyszerű kationos festék, közel semleges pH-n. A másik ugyanaz a festék, amelynek festőhatását lúggal fokozzák. A harmadik már nem is egyetlen festékanyag, hanem szándékosan oxidált keverék. Ha nem a megfelelőt használjuk, munka közben maga a festési elv változik meg.

A rövid válasz

Az egyszerű vizes metilénkék a kiindulópont: körülbelül 1% festékanyag vízben, egyszerű kationos festőoldat a baktériumok morfológiájának vizsgálatához és általános mikroszkópos munkához. A Loeffler-féle lúgos metilénkék készítésekor kis, kimért mennyiségű híg lúgot adnak egy vízzel hígított alkoholos törzsoldathoz. Ez megemeli a pH-t, és fokozza a kationos festék kötődését a baktériumok savas jellegű struktúráihoz. A polikróm metilénkék olyan metilénkék, amelyet lúgos közegben végzett oxidációval szándékosan érleltek. Az üveg így demetilezett homológok (azure A, azure B, azure C), tionin és metilénibolya keverékét tartalmazza a megmaradt metilénkék mellett, és ez a keverék a különböző struktúrákat eltérő árnyalatokra festi.

Ha csak egy mondatot jegyez meg: a lúgosítás a festés intenzitását, a polikromizálás pedig a festés színeit változtatja meg.

Egyszerű vizes metilénkék: a viszonyítási alap

A legegyszerűbb összetétel vízben oldott metilénkék, rendszerint 1% w/v koncentrációban, lúg hozzáadása és oxidáció nélkül. A színes komponens a klorid ellenionnal társuló metiltionínium-kation: egy kisméretű, sík szerkezetű fenotiazin-festék, amelyet a PubChem metilénkék-adatlapja metiltionínium-kloridként ír le. Kationként a nukleinsavak foszfátvázához és a baktériumok sejtfalán található savas csoportokhoz kötődik, így a sejteket világos háttér előtt kékre színezi.

Előnye a kiszámíthatóság. A sejtmagok és a baktériumok kéknek látszanak. A kontraszt mérsékelt. A nehezen látható mikroorganizmusok gyengén festődhetnek, és Loeffler éppen ezt a korlátot kívánta megszüntetni. Az egyszerű baktériumfestések tágabb családjáról, amelybe ez az oldat is tartozik, a baktériumok egyszerű festésének áttekintése ad tájékoztatást. A pontos azonosítás itt is fontos: a metilkék teljesen más molekula, amint azt a metilkék és metilénkék összehasonlítása bemutatja. Ha tehát a katalógusban kizárólag a szín neve alapján keresünk, könnyen más festékosztályhoz jutunk.

Loeffler-féle lúgos metilénkék: ugyanaz a festék, erősebb hatással

A klasszikus Loeffler-recept alkoholos metilénkék-törzsoldatot kombinál vizes híg lúggal. A tankönyvi változatok 0.3 g festékanyagot írnak elő 30 mL 95%-os etanolban, valamint 100 mL 0.01%-os vizes kálium-hidroxid-oldatot. Ezzel egyenértékű változat a 30 mL telített alkoholos metilénkék, 100 mL desztillált víz és 1 mL 1%-os KOH. Így körülbelül 0.3% festékanyagot tartalmazó, kifejezetten lúgos pH-jú munkaoldat keletkezik. A kereskedelmi változatok ugyanezt az elvet követik, és a Thermo Fisher mikrobiológiai festékeket bemutató katalógusa a Loeffler-féle lúgos metilénkéket a polikróm és vizes változatok mellett külön katalógustételként, eltérő rendeltetéssel sorolja fel.

A lényeg a lúg. A pH emelése deprotonálja a minta karboxil- és foszfátcsoportjait, növelve a negatív töltésű kötőhelyek sűrűségét. Az alkoholos törzsoldat eközben teljesen oldott állapotban tartja a festéket, így az monomer formában jut el ezekhez a kötőhelyekhez. Ennek eredménye a baktériumok gyorsabb és intenzívebb festődése, mint semleges vizes festékoldattal, a rutinszerű bakteriológiai kenetekből ismert mélykék pálcákkal és kokkuszokkal. A festési idő általában egy–három perc, amelyet vizes öblítés követ.

Klasszikus alkalmazása a Loeffler-féle szérumtáptalajon tenyésztett Corynebacterium diphtheriae festése: karcsú, gyakran bunkós végű pálcák, erősen festődő metakromatikus Babes–Ernst-szemcsékkel, amelyek tárolt polifoszfátot tartalmaznak. A táptalaj és a festék összekapcsolása történelmi eredetű, mindkettő ugyanahhoz a bakteriológushoz köthető, a diagnosztikai előnyt pedig a szemcsék kontrasztja adja. A diftériával kapcsolatos munkán túl a festőoldat általános bakteriológiai festékként használható tenyészetekből készített kenetekhez, a Neisseria morfológiájának vizsgálatához klinikai kenetekben, valamint minden olyan esetben, amikor Gram-festésre nincs szükség, de az egyszerű vizes kék túl halványnak bizonyul. Ez monokróm festés. Minden savas jellegű struktúra a kék valamely árnyalatát veszi fel. Ha egy protokoll színek szerinti elkülönítést kíván, azt a lúg önmagában nem biztosíthatja.

Egy gyakorlati figyelmeztetés: a lúgos festékoldatok tárolás és szén-dioxid-felvétel során romlanak, és csapadék képződik bennük. A laboratóriumok ezért vagy kisebb mennyiségeket készítenek, vagy megvásárolják a katalógusban szereplő oldatot, és betartják annak eltarthatósági idejét, ahelyett hogy tovább használnának egy régi üveget, amelyből már minden tárgylemezre üledék kerül.

Polikróm metilénkék: egy név, több festékanyag

A polikróm metilénkék ugyanabból a festékanyagból indul ki, de lúgos közegben szabályozott oxidációnak vetik alá, amelyet hagyományosan érlelésnek vagy polikromizálásnak neveznek. A lúgos közegben történő érlelés, a karbonáttal végzett melegítés vagy például dikromáttal végzett oxidáció lépésenként távolítja el a metilcsoportokat a dimetilamino-szubsztituensekről. A termék keverék: megmaradt metilénkék, azure B (egy metilcsoport elvesztése után), azure A és azure C (további demetilezés után), tionin (teljes demetilezés után), valamint a metilénibolya-családba tartozó oxidációs melléktermékek. Minden komponensnek saját árnyalata és szöveti affinitása van, így a keverék metakromatikusan fest: a sejtmagok, szemcsék, mucinok és a porc különböző, kéktől vörösesliláig terjedő árnyalatokat vesznek fel.

Ugyanez a kémia áll a jól ismert vérfestések mögött. A korai kutatók azt tapasztalták, hogy a lúgosított metilénkék lilás árnyalatokra festi a maláriaparaziták sejtmagjait, ám vizes, érlelt oldataik instabilak voltak, és néhány napon belül csapadék képződött bennük. A lila vérfestés feltalálásának történetét bemutató áttekintés leírja, hogyan használta ki ezt a hatást egymástól függetlenül Malachowski és Romanowsky 1891-ben, hogyan vezették be a metanolt a festékcsapadék stabilizálására és a kenetek hő nélküli fixálására, majd hogyan szabványosította később Giemsa a keveréket kimért azure B és eozin felhasználásával, glicerines stabilizálással. A modern Giemsa-típusú festések közvetlenül a polikróm metilénkék és az eozin kombinációjából származnak, amely a Romanowsky-hatást létrehozza. Az eozinnal való párosításról és az azure B komponensről részletesebben a Romanowsky-típusú festések és az azure B–eozin kölcsönhatás című cikkben olvashat.

Mivel keverék, a polikróm metilénkék természeténél fogva a három közül a legkevésbé szabványosított. Pontos színegyensúlya az oxidáció módjától és mértékétől függ, ezért a szövettani beszállítók külön termékként, saját teljesítményvizsgálattal értékesítik, nem pedig érlelt Loeffler-féle oldatként. Jellemző alkalmazásai közé tartozik a hízósejtek szemcséinek, a mucinoknak és a porcnak a metakromatikus kimutatása, a plazmasejtek részleteinek megjelenítése, valamint a Helicobacter pylori kimutatása szövetmetszetekben Goodpasture-típusú polikróm módszerekkel. Akkor megfelelő választás, ha a cél a szín szerinti elkülönítés, és akkor nem megfelelő, ha a protokoll tiszta, monokróm baktériumkörvonalat vár.

Az összetétel és a rendeltetés összehasonlítása

A táblázatot döntési útmutatóként olvassa. Ha a minta túl halványan festődik, változtasson a pH-n alapuló megközelítésen, és válassza a Loeffler-féle oldatot. Ha minden megfestődik, de semmi sem különül el, változtasson a festékanyag megközelítésén, és válassza a polikróm változatot. Ha egy Loeffler-féle festéssel készült keneten gyönyörűen látszanak a szemcsék, de a felettes azt kérdezi, miért ugyanolyan kék a sejtmag és a citoplazma, a válasz az, hogy egyetlen lúgos monokróm festék sem képes ezeket szín szerint elkülöníteni. Ez a feladat a polikróm családra és annak vérfestésre szolgáló származékaira tartozik.

A szokásos összetévesztések elkerülése

A félreértések többségéért két hiba felelős. Az első, hogy a Loeffler-féle oldatot az egyszerű metilénkékkel felcserélhetőnek tekintik, mert az üvegben mindkettő kéknek látszik. pH-juk és festési intenzitásuk eltér, és ha a Loeffler-féle oldat helyett semleges festéket használnak, éppen az a szemcsekontraszt vész el, amelyre a protokoll épül. A második hiba, hogy bármely régi vagy véletlenül megöregedett lúgos kék oldatot polikrómnak tekintenek. A szabályozatlan öregedés ismeretlen összetételű és ismeretlen festőerejű keveréket eredményez. A valódi polikróm oldatokat ezzel szemben meghatározott oxidációs eljárásokkal készítik, és a vérfestések fejlődési vonalában kimért eozinnal kombinálják. A történelem itt tanulságos: az 1890-es évek instabil, vizes, érlelt oldatai éppen azért adták át a helyüket a metanollal stabilizált összetételeknek, mert a szabályozatlan keverékeket nem lehetett reprodukálni. Ezt érdemes felidézni, mielőtt bizonytalan korú üvegből festünk meg egy diagnosztikai tárgylemezt.

A pontos elnevezés teszi teljessé a képet. Ellenőrizze a címkén a katalógustételt (vizes, Loeffler-féle vagy polikróm), a festékanyag-tartalmat és a rendeltetést, ne pedig a színből következtessen rájuk. A három összetétel kromofórjának közös az eredete. A rendeltetésük nem közös.