Tès ledven ak ble metilèn: konte selil vivan oswa mezire tan respirasyon

De tib chita sou tab laboratwa a. Toude ble. Nan youn, selil ble anba mikwoskòp la vle di ledven mouri. Nan lòt la, yon tib ki pase soti ble pou vin san koulè vle di ledven an vivan epi l ap respire. Menm koloran, entèpretasyon opoze. Si ou konfonn de tès yo, tout konklizyon yo vin tèt anba.

Se distenksyon sa a ki baz tout atik la. Ble metilèn se yon koloran redoks: lè li okside, li ble; lè li redui, li vin leko-ble metilèn san koulè. Konte selil pou estime viabilite sèvi ak chimi sa a nan yon obsèvasyon kout anba mikwoskòp. Yon eksperyans respirasyon sèvi avè l nan yon reyaksyon yo mezire sou tan nan tout melanj lan. Chak bezwen pwòp pwotokòl li, pwòp kontwòl li, ak pwòp analiz kritik li.

Konte pou viabilite: yon kolorasyon kout, pou li san pèdi tan

Pwotokòl yo sèvi nan brasri a se vèsyon ki pi estandadize a. Prepare ble metilèn 0.01% w/v nan sitrat sodyòm 2%, melanje li nan rapò 1:1 ak sispansyon ledven an, epi egzamine melanj lan apre yon entèval kout ki fiks. Entèval ki pibliye yo varye soti nan 1 rive 2 minit nan manyèl Brewing Science Institute la rive anviwon 5 minit nan pwotokòl rechèch yo; metòd OIV pou mikwobyoloji diven an mande pou egzamen an fèt nan 10 minit. Konsantrasyon koloran nan melanj pou konte a rive toupre 0.005%. Mete melanj lan nan yon chanm Neubauer amelyore, epi nan yon agrandisman anviwon 400x, klase selil ble fonse yo kòm selil ki pa viab, ak selil ki pa pran koulè yo kòm selil viab. Nan metòd OIV la, yo konte selil ble pal yo kòm vivan; sa deja montre pwoblèm jijman pèsonèl nou diskite pi ba a.

Konsantrasyon selil la soti nan jeyometri chanm lan. Lè yo konte tout kare santral 1 mm nan, kantite selil pa mL egal N fwa faktè dilisyon an fwa 10^4, kote N se kantite yo konte nan zòn sa a, jan sa dekri nan metòd ASBC pou ledven yo. Viabilite pi senp: selil ki pa pran koulè divize pa kantite total selil, fwa 100. Konte anviwon 400 selil pou estime viabilite, dapre etid konparatif FEMS sou brasri a ak pratik OIV la. Sèvi ak menm règ fwontyè a chak fwa; pa egzanp, enkli selil ki sou liy anba ak liy goch kadriyaj la, epi pa enkli sa ki sou liy anwo ak liy dwat yo.

Fòk gen yon règ pou boujon yo anvan konte a kòmanse. Yon konvansyon komen konte yon boujon kòm yon selil apa lè li rive anviwon mwatye gwosè selil manman an; si li pi piti pase sa, yo konte l ansanm ak manman an. Kèlkeswa règ ou chwazi a, aplike li nan chak kare epi ekri li sou fèy konte a pou pwochen moun nan ka fè menm bagay la.

Fèy konte (enprime sa a)

Fèy sa a se yon materyèl orijinal pou atik sa a. Kopye li nan yon kaye oswa enprime youn pou chak echantiyon.

Viabilite (%) = 100 x san koulè / (san koulè + ble fonse). Kantite total selil pa mL = N x faktè dilisyon x 10^4, kote N soti nan zòn chanm lan yo defini a. Ekri entèval kolorasyon an bò kote rezilta a, paske yon valè viabilite san tan li pa ka repwodui.

Poukisa valè viabilite yo varye

Tan se premye entèferans lan, epi li ka aji nan toude sans. Selil ki aktif nan metabolis yo redui koloran an; kidonk, si ou li rezilta a twò bonè, ou ka wè selil vivan anvan yo fini redui li epi klase yo kòm mouri pa erè. Men, yon ekspozisyon pwolonje toksik poukont li epi li kreye selil ble ki vrèman domaje, sa ki bay yon fo endikasyon lanmò nan kolorasyon an. Se poutèt sa yon pwotokòl ansèyman laboratwa presize pou klase selil yo nan 5 minit, jan sa dokimante nan yon pwotokòl ansèyman sou ledven nan Wisconsin. Fason ki pridan pou di sa se ke klasifikasyon ak ble metilèn depann de tan; kidonk, chwazi yon sèl entèval kout epi kenbe li menm jan pou tout echantiyon nan yon seri.

Echantiyon ki gen viabilite ba gen yon dezyèm sous patipri. Metòd estandadize a avèti ke ble metilèn ka bay yon estimasyon twò wo pou vrè viabilite lè li anba anviwon 80%, paske selil ki toujou redui koloran an pa nesesèman kenbe kapasite pou repwodui. Piblikasyon sou brasri yo dekri menm mank fyab la lè viabilite a bese anpil. Konsidere ble metilèn kòm yon estimasyon rapid ak apwoksimatif, epi konfime desizyon enpòtan ki baze sou viabilite ba, tankou re-itilize yon kilti pou lanse yon lòt fèmantasyon, avèk konte sou plak kilti oswa yon kolorasyon konplemantè.

Efè matris la vini an twazyèm. Metòd OIV la fèt toupre pH 4.6 epi li avèti ke echantiyon ki gen pH ba ak gwo kapasite tanpon anpeche koloran an konpòte li nòmalman. Li konseye tou pou pa fè tès la lè sik la depase 100 g/L, paske selil yo parèt ble pal yon fason ki ka twonpe moun. Yon konparezon eksperimantal sou pH kolorasyon te jwenn gwo chanjman nan sansiblite atravè seri pH yo te teste a, sa ki ann amoni ak yon etid sou yon metòd ble metilèn ki depann de pH. Debri se yon lòt pyèj: patikil ki pran koulè nan mach ki gen anpil enpurte sanble ak selil mouri epi yo ogmante varyasyon ant operatè yo.

Yo mezire varyasyon sa a; se pa senp temwayaj. Nan yon esè brasri pandan sis mwa, rapòte nan konparezon FEMS sou ledven an, mezi an doub ak ble metilèn te gen yon devyasyon estanda mwayèn 6.1%, kont 0.2% pou sitometri an koule ak oksònòl. De operatè te jwenn rezilta ki te diferan jiska 13 pwen pousantaj sou menm echantiyon an. Yon konparezon kantitatif metòd viabilite an 2023 te jwenn mikwoskopi fliyoresans ak sitometri an koule pi presi anpil, pandan li te montre pèfòmans lan depann de espès la ak matris la. Deskripsyon klasik metòd la pa Painting ak Kirsop (PMID 24430080) rete pwen referans lan, epi yon revizyon pi laj sou tès viabilite ak vitalite ledven (PMID 25154541) plase ble metilèn pami tès konplemantè yo olye de tès definitif yo. Ble tripan pa otomatikman yon pi bon chwa isit la: li endike pèt entegrite manbràn lan, tandiske ble metilèn endike antre koloran an ansanm ak aktivite rediksyon; kidonk, de koloran yo ka klase selil ki anba estrès yon fason diferan.

Eksperyans respirasyon an: mezire tan ble a pran pou disparèt

Dezyèm tès la pa sèvi ak mikwoskòp ditou. Ledven ansanm ak glikoz ak ble metilèn dilye antre nan yon tib fèmen, epi revèy la mezire konbyen tan ble a pran pou disparèt. Pandan selil yo fè metabolis, yo pwodui ekivalan rediktè ki transfòme koloran ble a nan fòm san koulè li a, tandiske oksijèn ki fonn nan melanj lan reokside li pou fè l tounen ble. Lè selil yo fin bese kantite oksijèn nan, rediksyon nèt la pran avantaj epi tib la pèdi koulè li. Kidonk, pwen final la reflete balans ant respirasyon, konsantrasyon koloran, ak disponiblite oksijèn. Yo dwe rapòte li kòm tan rediksyon oswa dekolorasyon ble metilèn, pa kòm yon mezi dirèk vitès konsomasyon oksijèn molekilè.

Sèvi ak yon koloran ki pi dilye anpil pase nan travay sou viabilite, pou tan an tonbe nan yon entèval pratik. Manyèl travay pratik obligatwa AQA A level la estandadize sa byen: 1 g glikoz pou chak 100 mL dlo chofe a anviwon 30 C, 5 g ledven sèk ajoute touswit anvan itilizasyon, ak yon solisyon koloran pou travay toupre 0.001%, prepare lè yo dilye 0.1 mL yon solisyon rezèv 1% pou rive nan 100 mL. Melanje 2 mL sispansyon ledven ak glikoz ak 2 mL solisyon koloran pou travay la, kite li rive nan tanperati tès la, souke yon sèl fwa pandan 10 segonn, demare kwonomèt la, epi pa souke ankò. Souke a re-entwodui oksijèn epi fè tib la tounen ble; se pi gwo atifak pwosedi a. AQA note preparasyon an ta dwe nòmalman pèdi koulè li nan anviwon 5 minit a 35 C, avèk mwayèn esè 275 s a 20 C, 128 s a 35 C, ak 145 s a 45 C. Sa yo se egzanp ki soti nan yon sèl montaj, pa referans inivèsèl. Etid espesifik sou rediksyon soutni lyen kantitatif ant vitès rediksyon ak ledven ki aktif nan metabolis anba kondisyon kontwole, tankou travay ki endekse kòm PMID 25773544 ak etid sou mekanis la nan Yeast (2014).

Demonstrasyon evolisyon sou tan (materyèl orijinal)

Tablo ki anba a se yon demonstrasyon orijinal ki pwodui pou atik sa a avèk montaj nan stil AQA ki dekri pi wo a: 2 mL melanj ledven ak glikoz ansanm ak 2 mL solisyon koloran pou travay toupre 0.001%, yon sèl soukous pandan 10 segonn, apre sa yon enkibasyon san deranjman. Valè yo se egzanp lekti nan fòma yon gwoup elèv ta dwe note, kote endis vitès la defini kòm 1 divize pa tan dekolorasyon an an segonn. Fè eksperyans lan ak menm tib yo epi ranplase valè sa yo ak valè ou mezire.

Trase endis vitès la selon tanperati pou tib A, B, ak C. Koub la monte, apre sa li vin plat oswa li desann; se fòm yo atann pou yon pwosesis anzim dirije, pa yon liy dwat. Tib D, E, ak F pa pwen done sou koub sa a. Yo se kontwòl ki pèmèt entèprete koub la.

Kontwòl ki bay chak tès yon sans

Chak seri tès respirasyon bezwen twa tès ki mache avè l. Ledven bouyi oswa touye ansanm ak glikoz ak koloran ta dwe rete ble, sa ki montre rediksyon rapid la depann de metabolis selil vivan. Ledven vivan ansanm ak koloran san glikoz ajoute se yon kontwòl pou sibstra a, men atann yon dekolorasyon dousman kanmenm, paske ledven an sèvi ak rezèv entèn li yo. Glikoz ansanm ak koloran san ledven se blan chimik la; li esansyèl paske glikoz nan yon anviwònman alkalin ka redui ble metilèn san okenn selil prezan.

Konte pou viabilite bezwen yon lòt kalite kontwòl: kenbe pwosedi a konstan. Menm solisyon rezèv koloran, menm rapò melanj, menm entèval kolorasyon, menm zòn chanm, menm règ pou boujon ak fwontyè, epi fè konte a san konnen idantite echantiyon an lè sa posib. Lè de operatè gen yon diferans dis pwen, fèy konte a anjeneral montre kòz la: tan diferan, papòt ble diferan, oswa règ boujon diferan. Teknik pou prepare ak obsève selil ki kolore yo gen rapò ak metòd kolorasyon senp pou bakteri, tandiske yon apèsi pi laj sou sa koloran an make nan diferan echantiyon parèt nan atlas kolorasyon pou mikwoskopi a. Pou prensip fizik ki dèyè mezi kantitatif nenpòt entansite ble, referans absòpsyon ki make kondisyon yo eksplike poukisa chak koyefisyan dwe toujou akonpaye ak kondisyon sòlvan, pH, ak konsantrasyon li yo.

Chwazi tès la selon kesyon an. Konbyen selil ki vivan kounye a se yon kesyon konte, ki jwenn repons anba mikwoskòp avèk yon fèy konte. Nan ki nivo kilti sa a ap respire aktivman se yon kesyon sinetik, ki jwenn repons avèk yon kwonomèt ak tib kontwole. Ble metilèn sèvi pou toude, men li pa janm fè toude nan menm tib la an menm tan.