Mezire efè ble metilèn sou mitokondri: oksijèn, ATP, ak potansyèl manbràn

Ann sipoze yon laboratwa ajoute ble metilèn nan mitokondri ki gen respirasyon ki deregle epi li wè konsomasyon oksijèn ogmante. Fraz ki ta vin natirèlman se di koloran an retabli fonksyon mitokondri yo. Fraz sa a ka pa kòrèk. Fliks oksijèn, sentèz ATP, ak potansyèl manbràn se twa konsèp diferan. Yo pataje menm òganit la menm jan sovgad, senkronizasyon, ak pataj pataje menm dosye nan nwaj la: yo gen rapò, men yo suiv règ diferan. Si ou konfonn youn ak lòt, entèpretasyon an pa kenbe, menm lè chak mezi teknikman kòrèk.

Ble metilèn fasilite konfizyon sa a paske li patisipe nan sistèm l ap mezire a. Li se yon ajan ki fè sik redoks, ki aksepte elektwon nan etap ki pi bonè yo epi bay yo nan etap ki pi ta yo; li se yon katyon lipofil ki akimile nan mitokondri ki gen enèji; epi li se yon konpoze ki gen yon koulè ble fò, ki absòbe epi emèt limyè nan menm bann ak sond yo itilize souvan yo. Yon sèl mezi pa ka bay tout enfòmasyon sa yo. Apwòch ki fyab la, jan etid sou mitokondri nan Budapest yo montre l, se mezire fliks oksijèn ansanm ak vitès sentèz ATP, potansyèl manbràn, ak liberasyon pewoksid idwojèn, avèk kontwòl espesifik pou koloran an nan chak etap.

Respiwometri mezire fliks oksijèn, pa pwodiksyon enèji

Respiwometri wo rezolisyon, kit li fèt ak Oroboros Oxygraph oswa analizè fliks ekstraselilè Seahorse, rapòte yon sèl bagay: konbyen vit oksijèn ap sibi rediksyon. Li pa rapòte konbyen pwoton yo ponpe pou chak elektwon, konbyen gradyan yo konsève, oswa si ATP sentaz sèvi avè l.

Vokabilè a enpòtan. Nan mitokondri izole, sibstra san ADP bay respirasyon ak flit pwoton, sibstra ak ADP nan nivo saturasyon bay kapasite fosforilasyon oksidatif, epi titraj ak yon ajan dekouplan bay kapasite maksimòm transfè elektwon. Nan selil entak, ekivalan Seahorse yo se respirasyon debaz, respirasyon ki lye ak ATP epi ki sansib a oligomycin, flit pwoton, respirasyon maksimòm FCCP defini, ak konsomasyon oksijèn ki pa soti nan mitokondri epi ki reziste rotenone ansanm ak antimycin. Lè yo rele rezilta Seahorse yo Eta 3 ak Eta 4, sa bay enpresyon yon presizyon preparasyon an pa sipòte, jan kad Mito Stress Test Agilent la montre klèman.

Ble metilèn kraze lyen entwitif ant plis oksijèn ak plis enèji. Nan mitokondri izole nan sèvo kochon Gine, koloran nan konsantrasyon 100 nM rive 1 uM ogmante konsomasyon oksijèn nan repo avèk sibstra glutamate ansanm ak malate, succinate, ak alpha-glycerophosphate, avèk yon ogmantasyon apeprè 64 pousan sou alpha-glycerophosphate. Men, respirasyon ADP estimile nan mitokondri ki an bon eta rete prèske san chanjman, dapre etid sou mitokondri izole nan sèvo a. Paske respirasyon ak flit la ogmante pandan fliks ADP estimile a rete menm jan, rapò kontwòl respiratwa yo kalkile a bese. Bès sa a pa vle di koloran an domaje mitokondri yo. Li vle di koloran an ajoute yon sik redoks ki konsome oksijèn anplis respirasyon nòmal la. Yon tès konsomasyon oksijèn ak ble metilèn ki rapòte sèlman ogmantasyon an mezire yon reyaksyon chimik reyèl, men li pa di anyen sou konsèvasyon enèji.

Eksperyans retablisman yo montre menm diferans lan sou yon pi gwo echèl. Lè Konplèks I bloke, fliks oksijèn ogmante apeprè twa fwa, tandiske sentèz ATP ogmante sèlman apeprè 1.5 fwa. Plis oksijèn rive nan elektwòd la. Yon pi piti pati ladan l sèvi pou pwodui ATP. Nenpòt deklarasyon ki di fosforilasyon oksidatif amelyore bezwen done sou ATP tou, depreferans sou fòm yon rapò ATP pou chak oksijèn, avèk konvansyon yo itilize pou denominatè a presize.

Tès ATP mezire vitès sentèz, epi kantite ATP a pa ka ranplase li

Yon tès ATP reponn yon lòt kesyon: konbyen ATP ki pwodui pou chak inite tan. Yon mezi sinetik, swa atravè liminesans lisiferaz koukouy yo suiv pandan plizyè minit, swa atravè yon tès makonnen ak hexokinase ansanm ak glucose-6-phosphate dehydrogenase yo li nan 340 nm, bay yon vitès. Yon sèl mezi ATP total nan pwen final bay kantite ATP ki prezan, ki reflete sentèz mwens konsomasyon epi ki poukont li di ou ti kras sou fosforilasyon oksidatif.

Gwoup Budapest la itilize metòd anzimatik makonnen an pandan yo siprime adenylate kinase, epi yo jwenn ble metilèn nan 1 rive 2 uM ogmante pwodiksyon ATP yon ti jan, men yon fason siyifikatif, nan mitokondri yo trete ak rotenone ak antimycin. Sa se yon retablisman reyèl, epi li pasyèl. Etid sou toksisite TEGDMA a jwenn menm kalite rezilta nan yon lòt modèl: monomè dantè TEGDMA nan 5 mM fè respirasyon ki lye ak Konplèks I tonbe soti nan apeprè 286 pou rive 28 inite fliks, epi koloran nan 2 uM remonte l nan apeprè 86.

De kontwòl obligatwa lè w ap travay ak yon konpoze redoks ki gen koulè. Premyèman, itilize oligomycin pou detèmine ki pati nan sentèz ATP yo mezire a ki depann de ATP sentaz. Dezyèmman, fè yon tès rekiperasyon apre adisyon ATP nan yon sistèm san selil, avèk yon kantite ATP ou konnen, reyaktif konplè, ak egzakteman menm konsantrasyon koloran yo itilize yo, omwen 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, ak 2 uM. Koloran an ka absòbe limyè ki emèt la, anpeche anzim rapòtè a fonksyone, oswa modifye chimi redoks reyaktif la. Gid jeneral pou tès lisiferaz yo rekòmande kontretès biyochimik jisteman pou kalite entèferans sa a. Pa sipoze 1 uM pa gen artefak jis paske ateniasyon fliyoresans anjeneral pi fò nan konsantrasyon ki pi wo.

Sond potansyèl manbràn mezire distribisyon koloran, pa fliks

Safranine O, TMRM ak TMRE, rhodamine 123, ak JC-1 se katyon ki ka travèse manbràn. Yo akimile nan matris ki gen chaj negatif la selon ekilib elektwochimik, kidonk fliyoresans global la endike potansyèl la endirèkteman atravè kote sond la ye. Okenn nan yo pa mezire ATP oswa fliks elektwon.

Chak sond gen yon preparasyon ki pi apwopriye pou li. Safranine O adapte ak mitokondri izole ak selil yo rann pèmeyab, anjeneral nan anviwon 2 uM avèk eksitasyon toupre 495 nm ak emisyon toupre 585 nm. Li fonksyone nan yon mòd ateniasyon fliyoresans kote absòpsyon sond la chanje fliyoresans global la. TMRM ak TMRE adapte ak selil entak lè chajman an fèt nan konsantrasyon nanomolè ki ba, nan mòd san ateniasyon fliyoresans, kote depolarizasyon libere koloran an epi fliyoresans mitokondri a bese; lè chajman an wo, direksyon siyal la ka ranvèse akoz oto-ateniasyon. JC-1 bay yon rapò vèt sou wouj ki pratik, men li depann de chajman an ak mas mitokondri yo, sa ki fè li mwens apwopriye pou travay kantitatif pase TMRM ki byen kontwole. Konpwomi sa yo rezime nan yon revizyon sou sond potansyèl manbràn mitokondri yo itilize anpil.

Ble metilèn lakòz entèferans optik nan egzakteman konsantrasyon yo itilize nan eksperyans yo. Bann absòpsyon li yo, toupre 600 rive 665 nm, sipèpoze ak emisyon wouj sond yo, kidonk efè filtè entèn, ateniasyon fliyoresans, ak absòpsyon limyè eksitasyon se tout posiblite kredib. Koloran an se tou yon dezyèm katyon lipofil, epi pwòp distribisyon li chanje avèk potansyèl y ap mezire a. Pwoteksyon an se mezi redondan ansanm ak echantiyon blan: sond poukont li, koloran poukont li, sond ansanm ak chak konsantrasyon koloran, depolarizasyon konplè avèk FCCP kòm referans zewo, epi depreferans yon dezyèm sond ki gen pwopriyete optik diferan. Etid sou kontounman Konplèks III a etabli presedan sa a lè li repete mezi retablisman potansyèl manbràn ak toude safranine O ak TMRM apre inhibisyon ak antimycin ak myxothiazol, epi li jwenn menm retablisman kalitatif la. Yon sèl rapòtè optik se yon endis. De rapòtè endepandan se prèv.

Twa preparasyon, twa kesyon diferan

Mitokondri izole, selil yo rann pèmeyab, ak selil entak pa twa reglaj sansiblite ou ka echanje nan menm tès la. Yo se konsèp diferan ki fonksyone selon prensip diferan.

Mitokondri izole konsève chèn transpò elektwon, manbràn entèn, ak sistèm fonksyonèl matris la, pandan yo retire manbràn plasmatik, sitozòl, ak achitekti rezo a. Retire eleman sa yo se objektif la: sibstra, ADP, inibitè, ak konsantrasyon koloran yo defini egzakteman, kidonk li posib pou idantifye yon chemen. Pri pou peye a se pèt apwovizyònman natirèl an sibstra, siyalizasyon, ak demann.

Selil yo rann pèmeyab kenbe mitokondri yo andedan yon gwo pati nan achitekti selilè yo, pandan yo kite sibstra ki soti deyò ak ADP pase atravè manbràn plasmatik ki ouvè a. Yo se zouti ki apwopriye pou idantifye yon defo nan yon chemen ki itilize yon sibstra nan yon kontèks selilè. Si yo rann selil yo twò pèmeyab, sa domaje manbràn ekstèn mitokondri yo, epi regilasyon sitozolik la pèdi pandan lavaj la.

Selil entak konsève tout bagay: baryè manbràn plasmatik la, ajan rediktè nan sitozòl la, transpò sibstra andojèn, rezo mitokondri a, ak demann ATP. Yo pi pre fizyoloji epi pi lwen mekanis la, paske antre koloran an, rediksyon li, ak retansyon li nan konpatiman yo tout enfliyanse ekspozisyon reyèl mitokondri yo.

Etid TEGDMA a itilize twa nivo yo espre: mitokondri izole nan sèvo pou evalye retablisman oksidasyon ak potansyèl pa koloran an, selil souch nan kaka dan yo rann pèmeyab sitou pou lokalize defo a nan oksidasyon sibstra ki lye ak Konplèks I, epi selil souch entak pou evalye efè fizyolojik nèt koloran nan 2 uM sou konsomasyon oksijèn ki te diminye. Pou lektè k ap konpare mezi mitokondri atravè diferan preparasyon, atik konpayon ki eksplike kijan ble metilèn deplase elektwon nan chèn respiratwa a bay enfòmasyon debaz sou chemen an, epi gid pou li etid respirasyon ak ble metilèn lan esplike lojik konsantrasyon ak inibitè yo.

Kontwòl yon koloran ki aktif nan reyaksyon redoks mande

Yon ajan ki fè sik redoks bezwen yon lis kontwòl ki pi long pase yon inibitè òdinè, paske chimi koloran an poukont li ka imite biyoloji.

Pou respiwometri, itilize yon chanm ki gen sèlman tanpon pou mezire derive a, yon chanm ki gen tanpon ansanm ak koloran san materyèl biyolojik, koloran ansanm ak nenpòt ajan rediktè ekstraselilè ki prezan nan tès la, epi rotenone ansanm ak antimycin nan fen tès la pou defini konsomasyon oksijèn ki pa soti nan mitokondri nan selil entak. Remake koloran ki redui a reoksidize lè li transfere elektwon bay oksijèn pou fòme pewoksid idwojèn. Kidonk, yon echantiyon blan ki gen sèlman koloran san yon donè elektwon souzestime konsomasyon oksijèn san selil ki parèt lè NADH oswa NADPH disponib.

Pou pewoksid idwojèn, pito Amplex UltraRed kalibre ansanm ak peroksidaz refor pase koloran DCFDA ki pa selektif yo, verifye avèk katalaz, epi teste depandans sou ekleraj, paske koloran an se yon fotosansibilizatè. Etid sou mitokondri nan sèvo a jwenn chaj pewoksid la ogmante plis pase kat fwa avèk sèlman 100 nM koloran pandan eliminasyon an ralanti, epi pewoksid la fòme dirèkteman pa koloran ki redui a san yon entèmedyè sipèoksid. Detay sou chwa sond ak kontwòl limyè yo nan atik konpayon sou mezi espès reyaktif oksijèn nan eksperyans ak koloran, epi kesyon pi laj sou kilè pewoksid aji kòm siyal oswa kòm chaj la trete ansanm ak ekilib redoks selilè ak deklarasyon sou antioksidan.

Pou deklarasyon sou chemen yo, teste toude sit inibitè Konplèks III yo: antimycin A nan sit Qi a ak myxothiazol nan sit Qo a, ansanm ak yon pwen final Konplèks IV avèk syanid. Yon etid ki te fèt pi bonè sou sèvo sourit rapòte koloran an retabli respirasyon rotenone te bloke, men li pa retabli respirasyon antimycin te bloke. Tandiske etid ki fèt pita sou twa espès la jwenn yon retablisman pasyèl avèk toude inibitè yo ak prèv rediksyon dirèk cytochrome c. Konsidere kontounman an kòm yon mekanis ki konpatib ak done ki pi resan yo, olye yon bagay ki deja etabli nèt, paske konsantrasyon koloran, sit inibitè, eta sibstra, ak distribisyon koloran tout chanje chemen yo obsève a.

Matris seleksyon tès

Sèvi ak tablo sa a pou chwazi mezi a selon kesyon an, pa pou chwazi kesyon an selon mezi a.

Pou yon deklarasyon minimòm ki konvenkan, fòk yo teste menm konsantrasyon koloran yo, 100 nM, 300 nM, 1 uM, ak 2 uM, sou fliks oksijèn nan kondisyon flit, ADP, oligomycin, ak ajan dekouplan; sou vitès sentèz ATP; sou potansyèl manbràn, depreferans avèk de sond; epi sou liberasyon pewoksid kalibre avèk katalaz ak kontwòl san selil. Rapòte seri mezi ki lye yo: fliks oksijèn ansanm ak vitès ATP, ATP pou chak oksijèn, potansyèl, ak pewoksid. Nenpòt nan chif sa yo poukont li se yon mezi k ap chèche yon sans.