Mezire espès reyaktif oksijèn nan eksperyans ak ble metilèn

De laboratwa fè sa yo chak rele yon eksperyans antioksidan ak ble metilèn. Youn rapòte koloran an diminye espès reyaktif oksijèn yo. Lòt la rapòte li pwodui yo. Toude montre koub repons selon dòz ki byen klè. Toude sensè. Diferans lan pa soti nan fwod oswa enkonpetans. Se paske de gwoup yo mezire bagay diferan anba ekleraj diferan, avèk sond ki reponn kesyon diferan, epi yo dekri toude repons yo ak menm mo a: ROS.

Ble metilèn se yon molekil ki difisil pou mezire avèk presizyon paske li patisipe nan reyaksyon chimik li sipoze obsève yo. Nan fènwa, li transpòte elektwon ant donè ak akseptè epi li retounen nan fòm li te genyen okòmansman, pare pou rekòmanse sik la. Anba limyè, li vin yon fotosansibilizatè, li rive nan yon eta triplet eksite kote li ka bay oksijèn enèji pou fòme oksijèn singilè oswa transfere elektwon pou fòme radikal ak pewoksid idwojèn. Nenpòt sond yo mete nan sistèm sa a ka sibi oksidasyon, rediksyon, dekolorasyon, oswa koloran an li menm ka maske siyal optik li. Donk, premye kesyon pou nenpòt rezilta mezi ROS se pa janm ki chif li bay. Se sa tès la detekte toutbon, ak sa koloran an fè sou tès la.

Amplex Red: yon tès pewoksid idwojèn kalibre

Konbinezon ble metilèn ak Amplex Red se asosyasyon ki pi solid nan piblikasyon syantifik sa yo, lè yo mete li an plas kòrèkteman. Reyaksyon chimik la espesifik: pewoksidaz refor sèvi ak pewoksid idwojèn pou okside sibstra Amplex la pou bay yon pwodui fliyoresan, rezorifin, nan yon rapò estekyometrik apeprè youn pou youn. Pewoksid ki nan echantiyon an vin bay fliyoresans nan detektè a. Pa gen okenn lòt espès nan fanmi ROS klasik la ki deklanche reyaksyon sa a dirèkteman.

Avantaj desizif la se kalibrasyon. Yon moun k ap travay avèk swen teste etalon pewoksid ki gen kantite li konnen nan menm solisyon tanpon an, ak menm konsantrasyon pewoksidaz ak sibstra yo, menm tan enkibasyon an, ak menm paramèt optik yo, epi li konpare mezi echantiyon yo ak koub sa a. Nan etid sou mitokondri izole nan sèvo ki sèvi kòm baz metòd sa a, otè yo te fè egzakteman sa: yo te ajoute kantite pewoksid yo te konnen nan fen chak seri mezi, epi yo rapòte chif yo kòm vitès an pikomòl pa minit pa miligram pwoteyin olye de inite fliyoresans abitrè. Se sa ki fè yon limyè tounen yon mezi.

Twa detay nan etid sa a merite pou lòt moun suiv yo. Premyèman, otè yo te verifye siyal la ak katalaz, ki detwi pewoksid. Ogmantasyon fliyoresans ble metilèn nan te pwovoke a te sispann lè yo te ajoute katalaz, sa ki konfime siyal la te soti nan pewoksid olye de yon artefak optik. Dezyèmman, yo te teste ekleraj la dirèkteman lè yo te sèvi ak yon obtiratè sou reyon eksitasyon an pou echantiyon yo resevwa yon wityèm nan dòz limyè nòmal la, epi siyal la te bese sèlman nèf pousan. Plis pase katrevendis pousan pewoksid yo te rapòte a pa t depann de limyè yo te itilize pou mezi a. Twazyèmman, yo te mezire eliminasyon pewoksid la apa ak yon elektwòd epi yo te jwenn koloran an te ogmante pwodiksyon an epi li te ralanti eliminasyon an. Yon sond ki rapòte sèlman fliyoresans nèt la t ap melanje de efè sa yo.

Tès la toujou gen fason li ka bay move rezilta, epi ble metilèn lakòz plizyè ladan yo. Koloran an absòbe limyè sou yon gwo pati nan menm zòn wouj kote rezorifin emèt limyè a; konsa, lè konsantrasyon koloran an wo, echantiyon an ka maske pwòp siyal li atravè efè filtè entèn. Se poutèt sa etalon yo ta dwe gen menm konsantrasyon koloran ak echantiyon yo. Amplex Red kapab sibi foto-oksidasyon poukont li tou, epi pwodui li a, rezorifin, ka antre nan sik fotoredoks ki pwodui sipèoksid ak pewoksid; sa gen anpil enpòtans lè eksperyans lan klere yon fotosansibilizatè tou. Solisyon pratik la se iradye echantiyon ble metilèn yo dabò epi teste alikòt yo ak reyaktif Amplex nan fènwa, olye pou yo klere koloran an ak sond lan ansanm. Finalman, sipèoksid dismitaz pa senpleman diminye yon siyal Amplex: lè li konvèti sipèoksid an pewoksid, li ka ogmante siyal la. Yon kontwòl SOD ki ogmante fliyoresans pa yon echèk. Li idantifye sipèoksid kòm yon espès ki parèt pi bonè nan chèn reyaksyon an.

DCFDA: yon endikatè oksidasyon ki pa espesifik

Asosyasyon ble metilèn ak DCFDA se sous pifò konfizyon an. DCFH-DA se yon prekisè ki sèvi pou fè sond lan antre nan selil. Esteraz ki anndan selil la retire gwoup asetat li yo pou kite DCFH ki pa fliyoresan, epi oksidasyon DCFH bay DCF ki fliyoresan. Lis sa ki okside li yo long: radikal idwoksil, entèmedyè pewoksidaz ak èm, diyoksid azòt, asid ipoklore, ak radikal ki soti nan pewoksinitrit. Pewoksid idwojèn poukont li pa okside li dirèkteman nan okenn vitès ki itil; fliyoresans ki depann de pewoksid anjeneral bezwen fè, pwoteyin ki gen èm, oswa reyaksyon chimik pewoksidaz nan pwosesis la.

Kritik chak seksyon metòd ta dwe site a soti nan analiz Kalyanaraman ak kòlèg li yo te fè sou DCFH kòm yon sond, jan yo rezime li nan etid sou mitokondri sèvo ki te rejte DCFDA pou rezon sa a. Yo te montre koloran an reyaji dousman, ak yon estekyometri yo pa karakterize, san kalibrasyon valab, epi ak konpoze ki pa ROS. Sond lan anplifye sa li mezire a tou: oksidasyon DCFH ki enplike yon sèl elektwon pwodui yon radikal DCF ki reyaji ak oksijèn pou fòme sipèoksid, ki sibi dismitasyon pou bay plis pewoksid. Pwosesis mezi a kreye yon pati nan reyaksyon chimik li rapòte yo.

Okenn nan sa pa fè DCFDA initil. Sa fè li yon zouti depistaj, pa yon zouti idantifikasyon. Yon ogmantasyon nan fliyoresans DCF vle di oksidasyon sond lan ki depann de oksidan ogmante. Sa pa vle di pewoksid ogmante, epi sa sètènman pa vle di kantite total ROS ogmante, yon kantite okenn sond poukont li pa mezire. Travay pi ansyen sou ble metilèn ki te baze sou oksidasyon DCF pi wo pase yon mikwomolè te rapòte efè pwo-oksidan, tandiske lòt sistèm nan menm epòk la te rapòte pwoteksyon kont lanmò selil pewoksid pwovoke. Toude obsèvasyon yo ka vre pou menm koloran an nan kontèks redoks diferan, epi rezilta DCF la poukont li pa ka di ki oksidan ki te pote siyal la. Sa ki fè travay pi ansyen sou mitokondri sèvo a enpòtan se paske li te ranplase zouti depistaj sa a ak yon mezi pewoksid kalibre epi li te jwenn chaj la dirèkteman: menm san nanomolè koloran te ogmante liberasyon pewoksid plizyè fwa pou chak sibstra ak eta respiratwa yo te teste.

DCFDA gen yon lòt pyèj ki espesifik pou ble metilèn. Koloran an gen yon koulè entans epi li aktif nan reyaksyon redoks, kidonk li ka fè fliyoresans lan disparèt, etenn emisyon an, oswa okside sond lan atravè reyaksyon chimik ki pa depann de ROS selilè yo. Yon kontwòl san selil ki gen koloran ak sond men ki pa gen selil pa yon dekorasyon opsyonèl. Se eksperyans ki di ou si koloran an reyaji ak sond lan.

Kaptaj spin ak konsomasyon oksijèn: idantite ak fliks

Lè sond fliyoresan yo rapòte yon bagay ki kapab sibi oksidasyon parèt, rezonans spin elektwon avèk ajan kaptaj spin bay yon rezilta ki pi pre idantite bagay sa a. Etid klasik sou fotochimi ble metilèn nan te itilize ESR pou detekte radikal askòbat ki soti nan koloran, askòbat ak limyè, epi li te montre fòmasyon pewoksid nan eksperyans konsomasyon oksijèn ak fòmasyon radikal idwoksil fè katalize nan seri eksperyans kaptaj spin. Chak teknik te reponn kesyon lòt yo pa t kapab reponn: ESR te bay idantite radikal la, konsomasyon oksijèn te bay fliks reyaksyon an san li pa depann de okenn sond fliyoresan, epi konbinezon an te montre ni chemen oksijèn singilè ni chemen radikal yo t ap fonksyone nan menm sistèm ki te anba limyè a.

Rezilta 1984 sa a toujou sonnen tankou yon avètisman. Avèk ekleraj ak yon ajan rediktè prezan, koloran an te pwodui pewoksid, epi avèk fè prezan, sistèm nan te pwodui radikal idwoksil, espès ki pi reyaktif nan gwoup la. Otè yo te fè yon lyen ant sa ak askòbat nan je a epi yo te mete an kesyon itilizasyon san prekosyon nan je. Lektè jodi a ta dwe note kondisyon yo: limyè plis ajan rediktè plis fè. Retire nenpòt youn nan yo epi chemen reyaksyon an vin pi fèb oswa disparèt.

Elektwòd oksijèn yo gen itilite yo pou yon lòt rezon. Yon elektwòd tip Clark mezire konsomasyon nèt oksijèn, sa ki etabli reyaksyon redoks koloran an deklanche yo ap konsome oksijèn molekilè epi li bay done sinetik okenn artefak fliyoresans pa ka imite. Li pa idantifye pwodui a. Pewoksid, sipèoksid, dlo, ak dekonpozisyon oksijèn singilè tout konsome oksijèn. Fliks san idantite enkonplè menm jan ak idantite san fliks; se poutèt sa piblikasyon ki solid yo konbine elektwòd la ak yon tès pewoksid kalibre oswa yon ajan kaptaj.

Poukisa rezilta antioksidan yo kontredi youn lòt

Mete twa kalite mezi yo kòt a kòt, epi kontradiksyon ki parèt nan piblikasyon sou ble metilèn yo vin esplike pa diferans nan metòd yo ansanm ak twa reyalite byolojik.

Premyèman, koloran an se ni yon transpòtè elektwon ni yon sous pewoksid. Lè li detounen elektwon yo lwen sit respiratwa kote oksijèn ta tounen sipèoksid otreman, li ka diminye yon ROS pandan fòm redwi li a redui oksijèn dirèkteman an pewoksid, sa ki ogmante yon lòt. Yon laboratwa k ap travay sou reyaksyon redoks mitokondri yo ak wòl li kòm chemen kontounman ta dwe donk atann repons ki depann de sond lan: yon mezi ki sansib a sipèoksid bese pandan yon mezi pewoksid monte nan menm kivèt la.

Dezyèmman, pewoksid nan dòz ba se yon siyal, se pa sèlman domaj. Etid sou mitokondri sèvo sourit ki te suiv travay pi ansyen an te jwenn pwodiksyon pewoksid apati sèlman senkant nanomolè koloran san lezyon nan ADN mitokondri yo nan nivo terapetik, ansanm ak pwoteksyon kont lezyon rotenòn pwovoke apre tretman davans. Se sèlman nan san mikwomolè, byen pi wo pase entèval terapetik la, koloran an te domaje sèten fragman ADN; epi limyè wouj ansanm ak ven mikwomolè koloran te pwodui oksijèn singilè ki te domaje tout fragman yo te teste yo. Mekanis yo pwopoze a baze sou òmèz: yon pwodiksyon pewoksid modere deklanche defans antioksidan ki lye ak Nrf2 ansanm ak byojenèz mitokondri, konsa yon mezi pwo-oksidan sou kout tèm vini anvan yon rezilta antioksidan sou pi long tèm. Yon tès yo li apre yon èdtan ak yon tès yo li apre yon jou ka pa bay menm rezilta paske byoloji a chanje ant de moman yo.

Twazyèmman, limyè detèmine ki molekil ki prezan menm. Ekleraj retire gwoup metil nan koloran an pou fòme Azure B ak pwodui ki gen rapò avè l, epi limyè mikwoskòp la sou yon bwat kilti sifi pou fotosansibilize li. Eksperyans nan fènwa ak eksperyans anba limyè se eksperyans diferan, epi seksyon kontwòl pou ekleraj ak manipilasyon koloran nan nenpòt pwotokòl ta dwe trete yo konsa.

Yon seri kontwòl minimòm, ak fason pou li nenpòt deklarasyon

Konparezon ki anba a se materyèl referans orijinal pou atik sa a. Anvan ou aksepte nenpòt rezilta ROS sou ble metilèn, verifye ki liy otè yo ranpli ak kiyès yo sote.

Men yon règ pratik pou entèprete rezilta yo. Amplex avèk pewoksidaz, kalibre, ak yon verifikasyon ak katalaz, bay prèv sou pewoksid. DCFDA bay prèv sou oksidasyon sond ki pa espesifik, anyen plis. Kaptaj spin ak kontwòl ki sèvi ak ajan kapte radikal bay prèv sou idantite radikal yo. Konsomasyon oksijèn bay prèv sou fliks. Yon fraz ki deklare plis pase tès li a ka sipòte, kèlkeswa asirans li ekri avèk li, se yon fraz sou sond lan, pa sou koloran an. Diskisyon ki gen rapò ak depandans sou dòz ak entèval òmèz la, sikilasyon elektwon nan mitokondri, entèferans nan tès sou echantiyon kolore, ak artefak ekleraj nan mikwoskopi devlope chak nan pwen sa yo, epi chak rete valab lè yo ranplase referans pwovizwa li a.