Konstwi yon koub kalibrasyon ble metilèn: blan, entèval, ak lineyarite

De analis pataje yon sèl boutèy solisyon manman ble metilèn, epi yo chak konstwi yon koub kalibrasyon. Premye a jwenn yon liy dwat ki pase nan orijin nan epi li mezire echantiyon enkoni yo avèk konfyans. Dezyèm nan jwenn yon liy ki koube nan pati anlè a, yon òdone nan orijin ki pa pwoche zewo, ak rezilta echantiyon ki varye avèk dilisyon. Menm koloran, menm enstriman, menm longèdonn. Diferans lan se pa konpetans. Se konsepsyon an: sa ki te antre nan blan an, ki konsantrasyon yo te chwazi, epi si entèval yo te verifye a te rete nan zòn kote yon sèl modèl senp toujou valab.

Yon koub kalibrasyon se yon kontra ant repons yon enstriman ak yon konsantrasyon, ki valab sèlman nan kondisyon kote yo te konstwi li. Pou ble metilèn, kontra sa a gen yon pwen fèb yo konnen. Molekil koloran an asosye youn ak lòt nan dlo, kidonk espès ki absòbe limyè a chanje avèk konsantrasyon an. Yon koub ki kouvri chanjman sa a p ap dwat, epi okenn kantite analiz estatistik p ap korije sa. Atik sa a montre kijan pou konsevwa koub la pou liy lan gen sans: chwazi bon blan an, kenbe entèval la nan rejim monomè a, fè repetisyon yo san twonpe tèt ou, epi entèprete koubti kòm enfòmasyon olye kòm bri.

Kòmanse ak blan an, pa ak etalon yo

Blan an defini zewo, epi pou ble metilèn li dwe genyen tout bagay eksepte koloran an. Menm kalite dlo, menm tanpon ak pH, menm sèl, menm pwopòsyon ko-solvan, menm tanperati. Prepare solisyon etalon yo nan matris ki egzakteman menm jan an. Rezon an se chimik, li pa yon fòmalite administratif. Sèl ak solvan deplase balans ant monomè, dimè, ak pi gwo agrega, sa ki chanje espèk la nan longèdonn mezi a. Yon blan ki gen dlo sèlman pa ka korije yon chanjman nan distribisyon espès chimik matris la lakòz. Analiz global espèk ble metilèn nan dlo, ki disponib nan dosye aksè lib li a, te varye klori sodyòm ant 0 ak 0.15 M jisteman paske fòs iyonik deplase ekilib la, epi agregasyon te ogmante avèk sèl la.

Yon konsekans pratik: pa janm fè kalibrasyon nan dlo deyonize epi apre sa mezire echantiyon nan tanpon fosfat oswa nan filtrat dlo ize. Lè pa gen okenn matris ki pa gen sibstans w ap analize a, adisyon etalon dirèkteman nan echantiyon an pi bon pase yon koub ekstèn ki pa gen menm matris la. Gen konsèy ki gen rapò ak fason pou kenbe analiz nan dlo fyab nan diskisyon sou matris ak entèferans, epi apèsi sou konsepsyon analiz la kouvri prensip jeneral analiz kantitatif koloran yo.

Chwazi yon entèval kote yon sèl espès domine

Kantifikasyon nan bann longèdonn ki pi long lan, toupre 664 nm, sipoze pifò koloran an sou fòm monomè. Nan dlo senp, sipozisyon sa a valab sèlman pandan solisyon yo rete dilye, apeprè nan zòn konsantrasyon ba nan micromolar. Pant anpirik ki pibliye yo montre limit la: kalibrasyon yo kenbe anba anviwon 7 micromolar nan selil 1 cm bay yon pant toupre 82,000 M-1 cm-1, tandiske yon kalibrasyon ki pwolonje jiska anviwon 37 micromolar desann nan apeprè 67,100 paske etalon ki pi konsantre yo deja gen yon kantite dimè ki pa neglijab. Chak koyefisyan yo site isit la gen kondisyon li yo endike nan referans espèktral pou ble metilèn, ki se bon kote pou konpare valè yo; atik sa a sèvi avèk yo sèlman pou fikse entèval la.

Règ konsepsyon yo soti dirèkteman nan sa:

1. Kenbe etalon ki pi konsantre a ase dilye pou fòm espèk la rete estab. Pandan devlopman metòd la, eskane tout entèval vizib la (anviwon 550 rive 750 nm) pou chak nivo olye ou li yon sèl longèdonn. Si espèk nòmalize yo chanje fòm avèk konsantrasyon, chimi a ap chanje epi entèval la twò laj.
2. Swiv rapò absòbans toupre 610 nm sou absòbans toupre 665 nm nan tout nivo yo. Yon rapò ki monte avèk konsantrasyon vle di zepòl dimè a ap grandi epi modèl monomè a pa valab ankò. Gid sou agregasyon ak efè konsantrasyon esplike endikatè dyagnostik sa a pi plis.
3. Sèvi ak yon selil 1 cm pou travay nan konsantrasyon ba nan micromolar. Avèk yon pant toupre 82,000, 5 micromolar bay yon absòbans toupre 0.41 epi 10 micromolar bay anviwon 0.82; toude fasil pou pifò enstriman mezire.
4. Pou solisyon manman konsantre yo, diminye longè chemen optik la olye ou aksepte absòbans ki depase 1 anpil, men sonje yon chemen kout korije fotometri a, pa chimi a. Agregasyon depann de konsantrasyon, pa de longè chemen optik, kidonk yon solisyon manman konsantre toujou bezwen pwòp tretman pa li ki pran distribisyon espès chimik yo an kont, olye yon koub monomè dilye.

Ajisteman global ki soutni anpil nan deskripsyon sa a te kouvri 224 espèk ant 1.1 micromolar ak 3.4 millimolar epi li te jwenn siyal tetramè ki te deja detektab anba 34 micromolar. Konsta sa a bay bon direksyon an: fenèt lineyè a pi etwat pase sa entwisyon ta fè kwè, kidonk verifye li olye ou sipoze li valab.

Nivo, repetisyon, ak lòd

Yon koub ki gen twa pwen pa pwouve anyen. Konsèy validasyon nan ICH Q2(R2) mande omwen senk konsantrasyon pou evalye lineyarite, epi sis rive uit nivo ki pa zewo bay yon koub travay ki pi konvenkan, sitou nan pati anlè a kote agregasyon kòmanse. Distribye nivo yo pou kouvri entèval echantiyon ou prevwa a, avèk plis nivo kote koubti gen plis chans parèt, pa nan yon seri jewometrik ou chwazi paske li pratik.

Mezire chak nivo an doub oswa an trip, avèk preparasyon endepandan olye ou li menm solisyon nan yon sèl flakon twa fwa. Repetisyon endepandan yo revele erè preparasyon; lekti repete nan menm flakon an revele sèlman bri enstriman an. Etid global 2020 an te mezire chak solisyon twa fwa, sa ki toujou yon bon chwa pa defo. Mete lòd lekti a o aza pou devyasyon pwogresif, adsòpsyon sou vè, oswa chanjman tanperati pa ka fè w kwè gen koubti. Yon etid sou kivèt kwats te jwenn anviwon 3 pousan koloran an te adsòbe soti nan yon solisyon 34 micromolar nan 10 minit, kidonk kenbe tan kontak, kivèt, netwayaj, ak sekans yo konsistan pandan tout seri mezi a.

Egzanp kalkile pou ilistre metòd la (pa done mezire)

Chif ki anba yo envante pou montre kalkil yo. Yo pa mezi laboratwa epi yo pa dwe site kòm done sou ble metilèn. Sa ki enpòtan se seri verifikasyon ki akonpaye yo.

Ann sipoze gen sis etalon nan menm tanpon an, yon chemen optik 1 cm, ak lekti nan 665 nm kont blan ki gen menm matris la:

Yon ajisteman lineyè absòbans mwayèn kòm fonksyon konsantrasyon bay yon pant toupre 0.0805 inite absòbans pa micromolar ak yon òdone nan orijin ki a sèlman kèk inite mili-absòbans de zewo. Lè ou divize pant lan pa longè chemen optik la, ou konvèti li an yon absòptivite aparan: 0.0805 pa micromolar egal anviwon 80,500 M-1 cm-1, sa ki ann akò ak yon entèval kote monomè domine nan dlo. Verifikasyon ki enpòtan yo se pa R kare a, ki pral parèt ekselan nan nenpòt ka. Se òdone nan orijin ki prèske zewo, rapò A610/A665 ki rete plat soti nan S2 rive S5, ak rezidi ki gaye san tandans. Ti ogmantasyon rapò a nan S6 se siyal ki montre franchman ou dwe swa retire nivo sa a, swa make 7 micromolar kòm limit siperyè pwovizwa pou konbinezon matris ak enstriman sa a.

Yon echantiyon enkoni ki bay yon lekti 0.245 nan menm kondisyon yo konvèti dirèkteman: 0.245 divize pa 0.0805 pa micromolar bay anviwon 3.0 micromolar, anvan ou aplike nenpòt faktè dilisyon echantiyon. Rapòte rezilta a avèk kondisyon li yo: longèdonn, chemen optik, matris blan, entèval kalibrasyon, ak dat.

Fich kalibrasyon pou ranpli

Kopye modèl sa a nan dosye laboratwa a pou chak nouvo matris. Yon matris, yon fich, yon koub.

Liy pou fòm reyaktif la gen bon rezon pou li la. Ble metilèn komèsyal ka yon sèl san dlo oswa yon fòm idrate tankou triidrat la, epi yon move mas molè bay yon erè sistematik nan chak konsantrasyon nominal san sa pa parèt klè. Gid sou kalite ak klas yo kouvri verifikasyon pite ak espesifikasyon materyèl depa a.

Verifye avèk yon etalon kontwòl endepandan

Yon koub kalibrasyon pa dwe janm korije pwòp devwa li. Apre ajisteman an, prepare yon etalon kontwòl apati yon solisyon manman ou fè ak yon pezaj apa, nan yon konsantrasyon toupre mitan entèval aksepte a, epi li li kòm yon echantiyon enkoni. Yon rezilta ki dakò nan yon limit kèk pousan konfime chèn preparasyon an; si li pa dakò, sa mete solisyon manman an oswa dilisyon yo an koz olye enstriman an. Repete etalon kontwòl la avèk chak lo echantiyon. Si li devye pandan koub la pa chanje, sispèk solisyon travay yo oswa kivèt la anvan ou sispèk echantiyon yo. Sèl abitid sa a detekte pifò erè ki pase inapèsi yo: yon mas molè fòm idrate yo aplike sou yon boutèy fòm san dlo, yon mikwopipèt ki pa byen kalibre, yon tanpon yo prepare ak move fòs iyonik. Note pousantaj rekiperasyon etalon kontwòl la sou fich la bò kote pant lan, pou yon moun ki li li pita ka wè yo te teste liy lan, yo pa t sèlman trase li.

Entèprete nonlineyarite pou jwenn kòz la

Lè koub la koube, fòm pwoblèm nan ede idantifye kòz la. Yon koubti anba nan gwo absòbans, avèk yon fòm espèktral ki pa chanje, mete enstriman an an koz; souvan se limyè parazit ki fè gwo absòbans yo parèt pi ba pase yo ye. Koubti ki vini ansanm ak yon zepòl 610 nm k ap monte mete chimi a an koz: dimè ak pi gwo agrega absòbe yon fason diferan de monomè. Yon blan ki pa rive bay zewo, oswa etalon ki bay valè k ap bese avèk tan, mete resipyan an an koz: adsòpsyon sou vè oswa kivèt, sitou si tan kontak yo te varye pandan seri mezi a. Epi yon liy byen dwat ki pase nan pwen yo men ki toujou bay move rezilta pou echantiyon yo mete matris la an koz: echantiyon yo diferan de solisyon etalon yo, kidonk rekonstwi koub la nan matris echantiyon an oswa pase nan adisyon etalon. Nan chak ka, trase rezidi yo kòm fonksyon konsantrasyon. Yon dispèsyon o aza soutni modèl liy dwat la; yon fòm souri oswa yon fòm souri tèt anba demanti li yon fason ki pi fyab pase nenpòt papòt R kare, yon pwen konsèy validasyon yo soutni klèman.

Ble metilèn rekonpanse disiplin sa a. Bann monomè li a fò, chimi li byen dekri, epi fason li ka bay pwoblèm parèt nan espèk la anvan yo gate chif yo. Konstwi koub la sou yon entèval etwat, sèvi ak yon blan ki vrèman apwopriye, fè repetisyon endepandan, epi kite fòm espèk yo ede deside entèval la. Liy ki soti ladan l lan kout, men chak pwen sou li vre.

Kalkil ilistratif nan atik sa a sèvi ak chif envante pou demontre metòd la. Koyefisyan referans mezire yo, avèk tout kondisyon yo, parèt nan referans espèktral ki lye a, epi etid agregasyon ki soutni yo a endekse nan PMID 33251415.