Ble metilèn pou kolore DNA ak RNA: aplikasyon nan jèl ak sou manbràn

Yon etidyan fè elektwoforèz sou yon jèl agaroz, kolore li ak ble metilèn, epi li pa wè anyen kote li te espere yon bann byen vizib. Nan espas travay akote a, yon chèchè pòsdoktora kolore yon manbràn Northern ak menm boutèy ble a epi li jwenn bann ribozomal byen klè nan twa minit. Etidyan an konkli jèl la pa t mache. Jèl la pa t echwe. De travay yo te diferan, epi menm koloran an reponn yo ak sansiblite diferan, fon diferan, ak règ diferan pou sa k ap fèt apre.

Kolorasyon DNA ak ble metilèn ak kolorasyon RNA ak ble metilèn pataje menm chimi, men yo pa gen menm objektif. Nan yon jèl, koloran an montre kantite asid nikleyik ki nan yon matris pore. Sou yon manbràn, li montre si transfè a te mache epi si yo te chaje liy yo yon fason egal. Yon fwa diferans sa a klè, pwotokòl yo, limit deteksyon yo, ak limit konpatibilite yo vin pi fasil pou konprann.

Repons kout la

Ble metilèn se yon koloran katyonik plat ki mare ak asid nikleyik san lyezon kovalan epi yon fason revèsib, atravè yon melanj atraksyon elektwostatik pou fosfat, entèkalasyon ant pè baz, ak asosyasyon ak ti siyon an. Se revèsibilite sa a ki enpòtan. Yo ka kolore bann yo, wè yo ak limyè vizib, dokimante yo, epi retire koulè a oswa pirifye yo pou klonaj, ibridasyon, oswa yon nouvo analiz ak sond.

Pou kolore DNA ak de fil nan yon jèl agaroz ak ble metilèn, resèt rapid estanda a se 0.02 pousan w/v (200 mikwogram pou chak mL) nan dlo, anviwon 15 minit kolorasyon plis anviwon 15 minit dekolorasyon nan dlo, ak obsèvasyon sou yon bwat limyè blan. Pou manbràn, resèt klasik pou Northern blot la se 0.02 a 0.04 pousan koloran nan asetat sodyòm toupre pH 5.2, plizyè minit kolorasyon apre transfè ak imobilizasyon, apre sa yon rense ak dlo epi yon dekolorasyon konplè anvan ibridasyon. Sansiblite a limite: plizyè dizèn rive plizyè santèn nanogram pou chak bann nan jèl anba bon kondisyon, epi gid ki pi pridan yo bay 0.5 a 1 mikwogram. Sa plizyè lòd grandè pi wo pase limit deteksyon bromid etidyòm ak koloran SYBR yo. Sou manbràn, pa gen yon sèl limit deteksyon itil pou yon transkri endividyèl, paske koloran an sitou montre RNA ribozomal ki abondan ak kantite total materyèl ki te chaje a. Pa ranplase engredyan nan okenn nan resèt sa yo ak yon solisyon sipleman yo vann an detay. Metòd valide yo sipoze itilizasyon koloran kalite analitik, tanpon ki byen defini, ak manipilasyon san RNase lè gen RNA.

Kijan lyezon an mache, ak kote li ka twonpe

Modèl itil la gen twa pati. Premyèman, sistèm bag ki gen chaj pozitif la atire pa chèn fosfat ki gen chaj negatif la. Etid espektwoskopik yo jwenn kontribisyon elektwostatik sa a domine lè konsantrasyon sèl la ba, pandan modèl ak dinamik molekilè yo montre entèkalasyon ak lyezon nan ti siyon an rete mòd estab pou DNA ak de fil, jan sa rezime nan yon etid espektwoskopik sou lyezon ble metilèn ak DNA. Dezyèmman, gen yon sèten preferans pou GC: modèl yo favorize sekans vwazen CpG ak GpC, epi eksperyans yo rapòte yon asosyasyon preferansyèl ak estrikti de fil ki rich an GC nan travay sou preferans entèkalasyon ble metilèn, men estrikti de fil AT yo mare tou. Kolorasyon woutin pa espesifik pou yon sekans. Twazyèmman, DNA ak yon sèl fil ak RNA mare sitou atravè elektwostatik ak anpileman ak baz aksesib ak rejyon ki gen de fil, se poutèt sa entansite kolorasyon an varye selon longè, sekans, ak estrikti segondè.

Sa gen de konsekans. Paske lyezon an pa kovalan, lave retire koloran an. Bann nan poliakrilamid pèdi koulè yo byen vit sof si yo fikse yo espre, epi gen yon varyant espesyal pou fiksasyon pèmanan jisteman paske kolorasyon nòmal la tanporè, jan Soto ak Draper dekri sa pou jèl PAGE. Paske koloran an se yon fotosansibilizatè, yon ekspozisyon long ak limyè fò sou DNA ki kolore, nan prezans oksijèn, ka okside ganin epi finalman fè koupe sou fil yo; mekanis sa a detaye nan travay sou oksidasyon ganin fotosansibilize pa ble metilèn. Yon obsèvasyon kout ak limyè blan evite domaj UV yo byen konnen nan pwosedi klasik ak bromid etidyòm, epi avantaj sa a reyèl lè objektif la se rekipere DNA pou itilize apre. Limyè vizib pi dou, men li pa san danje. Kenbe tan ekleraj la kout lè DNA a pral sèvi pou klonaj. Pou fotochimi ki pi laj ki dèyè prekosyon sa a, gade de chemen nan fotochimi ble metilèn. Pou pè redoks la ak eta chaj yo ki esplike poukisa fòm okside a mare epi fòm redui a pa mare, gade chimi estrikti ak pwopriyete ble metilèn.

Premye travay: kolorasyon anndan jèl

Kolorasyon jèl reponn yon kesyon: èske gen ase asid nikleyik nan bann sa a pou je ka wè li? DNA ak de fil nan agaroz se ka yo pi byen karakterize a. Metòd orijinal Flores ak kolèg li yo pou jèl ak ble metilèn te valide pwotokòl rapid 0.02 pousan an sou agaroz 1 pousan epi li te montre rekiperasyon ak klonaj reyisi apre sa. Menm pwotokòl founisè a parèt sou paj pwodui ble metilèn IBI Scientific la, ki prezante resèt 0.04 pousan pou manbràn lan ak varyant rapid pou jèl la kòtakòt.

Pwosedi pratik:

1. Fè elektwoforèz sou jèl la nòmalman. Kolore apre elektwoforèz la, pa pandan li, sof si transfè oswa rezolisyon te valide pou yon metòd modifye.
2. Plonje li nan ble metilèn 0.02 pousan w/v nan dlo distile, ak ajitasyon dous, pandan anviwon 15 minit.
3. Dekolore nan dlo ou chanje plizyè fwa, pandan anviwon 15 minit an total, jiskaske koulè fon matris la diminye epi bann yo parèt klè.
4. Pran foto san pèdi tan sou yon aparèy ekleraj ak limyè blan.

Agaroz ak poliakrilamid pa konpòte yo menm jan. Agaroz kenbe koloran nan matris la, kidonk dekolorasyon se etap ki pran plis tan an. Jèl poliakrilamid ki mens kolore vit, men yo pèdi koloran vit tou, sa ki ede lè y ap koupe bann pou rekipere materyèl, men ki pa bon pou konsève dosye imaj. Yo ka lokalize oligonikleyotid sentetik nan poliakrilamid ak menm resèt 0.02 pousan an nan 20 a 30 minit ak lave repete nan dlo, selon metòd PAGE etabli nan stil Current Protocols. Yo te rapòte varyant ki trè dilye, toupre 0.0002 pousan nan TBE dilye, pou oligonikleyotid yo vle rekipere, pandan plizyè èdtan, men baz prèv la pi fèb.

Diferans ant DNA ak RNA enpòtan. DNA ak de fil bay lyezon estriktire ki pi fò a. RNA ak DNA ak yon sèl fil kolore, men pi fèb epi mwens previzib. Pou jèl RNA nan agaroz ak fòmaldeyid, pifò laboratwa pa fè kolorasyon ble nan jèl la; yo transfere RNA a sou yon manbràn anvan, epi yo kolore li la. Chanjman sa a ranplase yon siyal fèb nan jèl ak yon siyal pi klè sou manbràn, ansanm ak yon dosye sou chajman an.

Dezyèm travay: kolorasyon sou manbràn

Kolorasyon manbràn reponn yon lòt kesyon: èske transfè a te mache, epi èske liy yo konparab? Aplikasyon klasik la se kolorasyon revèsib Northern blot Herrin ak Schmidt la, ki te sèvi okòmansman ak koloran 0.04 pousan nan asetat sodyòm 50 mM nan pH 5.0 pandan 2 a 3 minit, ak yon rense ak dlo; yo te kapab retire li ak SDS dilye nan SSPE anvan ibridasyon.

Varyant modèn yo itilize anpil la fèt konsa:

1. Transfere RNA oswa DNA denatire sou nayilonn oswa nitroseliloz, epi imobilize li ak retikilasyon UV oswa chofaj pou echantiyon an pa pèdi pandan kolorasyon.
2. Opsyonèl men komen: mouye manbràn lan nan asid asetik 5 pousan pandan anviwon 15 minit.
3. Kolore pandan 5 a 10 minit nan ble metilèn 0.02 a 0.04 pousan nan asetat sodyòm 0.3 a 0.5 M toupre pH 5.2.
4. Rense epi dekolore nan dlo pandan 5 a 15 minit, dokimante, epi retire koloran ki rete a anvan ibridasyon.

Nayilonn ki gen chaj pozitif domine nan travay Northern. Nitroseliloz mache tou ak menm pwosedi asid asetik plis asetat la. Yo sèvi ak imaj la pou konfime transfè, pou konpare bann 28S ak 18S yo (oswa 23S ak 16S pou RNA bakteri), pou make nechèl ak estanda yo, epi pou kenbe yon dosye apwoksimatif pou nòmalizasyon RNA total. Metòd Northern ki pibliye yo mezire kantite nan bann ribozomal ki kolore yo pou verifye chajman, tankou travay nan syans letye ki te itilize bann ribozomal ki kolore ak ble metilèn pou nòmalizasyon. Yo ka vizyalize manbràn Southern menm jan an, men itilizasyon koloran an pi byen etabli kòm yon kontwòl chajman ak transfè pou Northern, epi DNA pou Southern denatire anvan transfè, kidonk chif sansiblite pou jèl yo pa aplike dirèkteman.

Limit deteksyon ak fon: kote ble a pèdi avantaj

Konparezon ki anba a apwoksimatif espre. Pèfòmans koloran depann de pousantaj jèl la, lajè bann yo, sistèm optik la, ak swen yo pran nan dekolorasyon. Konsidere chak chif kòm yon lòd grandè, pa yon espesifikasyon.

Kontwòl fon detèmine si siyal limite sa a itil. Koloran lib la gen yon koulè entans, kidonk kontras soti nan retire koloran ki pa mare san retire sa ki mare a. Yon koloran pi konsantre raman ogmante sansiblite. Sitou, li ogmante tan dekolorasyon an. Fè yon seri dilisyon sou egzakteman menm jèl, manbràn, ak kamera a, epi itilize sèlman ranje kote dansite entegre a rete pwopòsyonèl ak kantite materyèl yo mete a. Ble metilèn pèmèt nòmalizasyon semikantitatif chajman. Li pa yon tès kantitatif ki gen yon gwo ranje dinamik, paske kapasite manbràn, efikasite transfè, saturasyon, ak dekolorasyon varye soti nan yon liy rive nan yon lòt.

Limit konpatibilite: sa ki rete itil apre kolorasyon

Yo demontre klonaj apre kolorasyon ble. Flores ak kolèg li yo te koupe bann agaroz ki kolore, rekipere DNA a, fè ligasyon ak transfòmasyon avèk li, epi yo te rapòte pi bon klonaj pase apre bromid etidyòm ak UV. Rezon ki pi pwobab la se mwens domaj limyè, pa yon avantaj koloran an li menm bay. Kenbe ekspozisyon ak limyè blan kout epi pirifye DNA yo rekipere a ak yon pwosedi nòmal ekstraksyon nan jèl.

Gen mwens prèv pou PCR ak sekansaj. Koloran ki rete a mare ak asid nikleyik, kidonk dekolore epi pirifye anvan etap anzimatik yo. Yo atann DNA ki byen pirifye soti nan yon jèl ble ap mache, men tolerans pou koloran ki pase dirèkteman nan reyaksyon yo pa byen mezire atravè diferan polimeraz ak chimi sekansaj. Pa sipoze tolerans sa a.

Ibridasyon blot konpatib lè lòd la respekte estrikteman: transfere, imobilize, kolore, dokimante, dekolore, ibridize. Se sekans sa a Herrin ak Schmidt te konsevwa. Kolore anvan transfè, oswa sote dekolorasyon, se yon lòt metòd ki bezwen pwòp validasyon pa li. Apre yo retire koloran an, retire sond ak fè nouvo analiz ak sond selon metòd estanda mache nòmalman. Pou kolorasyon nan nivo selil ak menm fanmi koloran an, ak rezon ki fè lojik preparasyon fikse pa aplike nan metòd pou selil vivan, gade atlas kolorasyon pou mikwoskopi a.

Koupe bann mache pou agaroz ki sèvi pou rekiperasyon ak pou oligonikleyotid PAGE yo lokalize ak ble, depi yo evite varyant fiksasyon pèmanan an. Elektwoelisyon apre dekolorasyon plozib sou plan chimik pou yon ajan ki mare yon fason revèsib, men done kontwole sou randman ki espesifik pou ble metilèn ra. Retire sèl yo oswa presipite materyèl la apre elisyon.

Pwoblèm ki repete

Bann fèb nan jèl anjeneral vle di gen twò piti mas pou yon kolorasyon kolorimetrik, sitou pou sib kout ki gen yon sèl fil oswa sib RNA. Chaje plis, sèvi ak koloran fre, pwolonje kolorasyon an anvan ou ogmante konsantrasyon, epi sispann dekolorasyon pi bonè. Yon jèl ki ble nèt san kontras anjeneral vle di kolorasyon twòp oswa twò kèk chanjman dlo. Bann PAGE ki pèdi koulè se yon rezilta chimi yo atann, pa yon kolorasyon ki echwe. Pran foto vit. Yon fon manbràn ki pa egal montre posiblite pli, ti boul lè, mak dwèt, ajitasyon ki pa egal, oswa transfè pa plak. Pa entèprete sa kòm yon chajman ki pa egal san yon kontwòl ibridasyon. Yon modèl ribozomal fèb ak bann ki gaye ka vle di degradasyon, men tou transfè enkonplè, twò piti RNA total (liy tipik yo gen plizyè rive plizyè dizèn mikwogram), oswa dekolorasyon twòp. Koloran an montre RNA ribozomal ki abondan. Li pa montre yon transkri espesifik. Se sond lan ki fè travay sa a.

Sekirite ak manipilasyon san egzajerasyon

Ble metilèn pi senp pou manipile pase bromid etidyòm, men li pa san danje. Yon fich done sekirite aktyèl MilliporeSigma klase koloran an nan Kategori 4 pou toksisite oral egi, danjere si moun vale li, epi li mande eliminasyon atravè yon filyè dechè apwouve selon SDS ble metilèn Sigma-Aldrich la. Bromid etidyòm gen avètisman pi sevè sou jenotoksisite, tankou efè yo sispèk sou selil jèm nan SDS bromid etidyòm Sigma-Aldrich la, epi anjeneral yo mete jèl ak solisyon li yo apa kòm dechè chimik danjere, jan sa endike nan gid Thermo Fisher pou koloran asid nikleyik. Swiv SDS ak règ enstitisyon an pou toude. Kenbe koloran sèk la byen fèmen epi sèk, reitilize solisyon kolorasyon an sèlman jan pwotokòl la pèmèt, konsève manbràn ki kolore yo sèk ant fèy papye filtre, epi pran foto jèl yo anvan bann yo gaye pa difizyon.

Sonje fraz pou travay sou ban laboratwa a. Jèl yo teste vizibilite ak gwo chajman anba limyè blan. Manbràn yo teste transfè ak chajman anvan sond lan fè travay ki mande sansiblite a. Yon sèl koloran sèvi pou toude, ak sansiblite limite, lyezon revèsib, ak yon lòd operasyon estrik.