Mjerenje reaktivnih kisikovih vrsta u pokusima s metilenskim modrilom

Dva laboratorija provode ono što svaki od njih naziva pokusom antioksidacijskog djelovanja metilenskog modrila. Jedan izvještava da bojilo smanjuje reaktivne kisikove vrste. Drugi izvještava da ih stvara. Oba prikazuju jasne krivulje odnosa doze i odgovora. Oba su iskrena. Razlika nije u prijevari ni nestručnosti. Dvije su skupine mjerile različite stvari pri različitom osvjetljenju, sondama koje odgovaraju na različita pitanja, a zatim oba odgovora opisale istom riječi: ROS.

Metilensko modrilo teško je precizno mjeriti upravo zato što sudjeluje u kemijskim reakcijama koje bi trebalo promatrati. U mraku prenosi elektrone između donora i akceptora te se vraća u početni oblik, spremno za novi ciklus. Pod svjetlom postaje fotosenzibilizator i prelazi u pobuđeno tripletno stanje iz kojeg može prenijeti energiju na kisik i stvoriti singletni kisik ili prenijeti elektrone i stvoriti radikale i vodikov peroksid. Svaka sonda dodana u taj sustav može se oksidirati, reducirati, izblijedjeti ili biti optički zasjenjena samim bojilom. Zato prvo pitanje pri svakom očitanju ROS-a nikada nije kolika je vrijednost. Prvo je pitanje što test zapravo detektira i kako bojilo utječe na test.

Amplex Red: kalibrirani test vodikova peroksida

Kombinacija metilenskog modrila i Amplex Reda metodološki je najutemeljenija u ovoj literaturi, kada je pravilno postavljena. Kemijska reakcija je specifična: peroksidaza iz hrena koristi vodikov peroksid za oksidaciju supstrata Amplex u fluorescentni produkt, resorufin, uz približnu stehiometriju jedan prema jedan. Peroksid iz uzorka pretvara se u fluorescenciju koju bilježi detektor. Nijedna druga vrsta iz uobičajene skupine ROS-a ne pokreće tu reakciju izravno.

Presudna je prednost kalibracija. Pažljiv istraživač mjeri poznate standarde peroksida u istom puferu, s istim koncentracijama peroksidaze i supstrata, istim vremenom inkubacije i istim optičkim postavkama, a zatim očitava uzorke prema toj krivulji. U istraživanju izoliranih moždanih mitohondrija na kojem se ova metoda temelji autori su učinili upravo to: na kraju svakog mjerenja dodali su poznate količine peroksida, a rezultate su izrazili kao brzine u pikomolima po minuti po miligramu proteina, umjesto u proizvoljnim jedinicama fluorescencije. Upravo to pretvara sjaj u mjerenje.

Tri pojedinosti iz tog istraživanja vrijedi slijediti. Prvo, autori su provjerili signal katalazom, koja razgrađuje peroksid. Porast fluorescencije izazvan metilenskim modrilom zaustavio se nakon dodavanja katalaze, što je potvrdilo da signal potječe od peroksida, a ne od optičkog artefakta. Drugo, izravno su ispitali učinak osvjetljenja zatvaranjem pobudnog snopa tako da su uzorci primili jednu osminu uobičajene doze svjetla, a signal se smanjio za samo devet posto. Više od devedeset posto peroksida o kojem su izvijestili bilo je neovisno o svjetlu korištenom za mjerenje. Treće, zasebno su elektrodom mjerili uklanjanje peroksida i ustanovili da bojilo istodobno povećava njegovo stvaranje i usporava uklanjanje. Sonda koja prikazuje samo neto fluorescenciju spojila bi ta dva učinka.

Test ipak ima slabe točke, a metilensko modrilo otkriva nekoliko njih. Bojilo apsorbira u širokom rasponu istog crvenog područja u kojem resorufin emitira, pa pri visokim koncentracijama bojila uzorak može prikriti vlastiti signal zbog učinka unutarnjeg filtra. Standardi zato trebaju sadržavati istu koncentraciju bojila kao uzorci. Amplex Red može se i sam fotooksidirati, a njegov produkt resorufin može ući u fotoredoks ciklus koji stvara superoksid i peroksid, što je osobito važno kada se u pokusu osvjetljava i fotosenzibilizator. Praktično je rješenje najprije ozračiti uzorke metilenskog modrila, a zatim u mraku analizirati alikvote reagensima Amplex, umjesto zajedničkog osvjetljavanja bojila i sonde. Naposljetku, superoksid dismutaza ne smanjuje nužno signal Amplexa: pretvorba superoksida u peroksid može ga povećati. Kontrola sa SOD-om koja povećava fluorescenciju nije neuspješna. Ona je identificirala superoksid kao vrstu koja prethodi peroksidu u reakcijskom slijedu.

DCFDA: nespecifični pokazatelj oksidacije

Kombinacija metilenskog modrila i DCFDA izvor je većine zabuna. DCFH-DA je prekursor za unos u stanice. Esteraze unutar stanice uklanjaju njegove acetatne skupine, pri čemu ostaje nefluorescentni DCFH, a oksidacijom DCFH-a nastaje fluorescentni DCF. Popis tvari koje ga oksidiraju dugačak je: hidroksilni radikali, međuprodukti peroksidaze i hema, dušikov dioksid, hipoklorasta kiselina i radikali nastali iz peroksinitrita. Sam vodikov peroksid ne oksidira ga izravno dovoljno brzo da bi to bilo korisno; fluorescencija ovisna o peroksidu općenito zahtijeva sudjelovanje željeza, hemoproteina ili peroksidaznih reakcija.

Kritika koju bi svaki odjeljak o metodama trebao citirati potječe iz analize DCFH-a kao sonde koju su proveli Kalyanaraman i suradnici, kako je sažeto u istraživanju moždanih mitohondrija koje je zbog toga odbacilo DCFDA. Pokazali su da sonda reagira sporo, uz neodređenu stehiometriju, bez valjane kalibracije te i sa spojevima koji nisu ROS. Sonda ujedno pojačava ono što mjeri: oksidacijom DCFH-a uz prijenos jednog elektrona nastaje DCF radikal koji reagira s kisikom i stvara superoksid, a on dismutacijom daje dodatni peroksid. Očitanje dijelom samo stvara kemijske reakcije o kojima izvještava.

Ništa od toga ne čini DCFDA beskorisnim. Čini ga alatom za probir, a ne za identifikaciju. Porast fluorescencije DCF-a znači da se povećala oksidacija sonde ovisna o oksidansima. To ne znači da je porasla količina peroksida, a zasigurno ne znači ni da je porasla ukupna količina ROS-a, koju nijedna pojedinačna sonda ne mjeri. Ranija istraživanja metilenskog modrila koja su se oslanjala na oksidaciju DCF-a pri koncentracijama iznad jednog mikromola po litri izvijestila su o prooksidacijskim učincima, dok su drugi sustavi u istom razdoblju pokazivali zaštitu od stanične smrti izazvane peroksidom. Oba opažanja mogu biti točna za isto bojilo u različitim redoks uvjetima, a sam rezultat DCF-a ne može otkriti koji je oksidans nosio signal. Važnost ranijeg istraživanja moždanih mitohondrija jest u tome što je taj probir zamijenilo kalibriranim mjerenjem peroksida i izravno utvrdilo opterećenje: čak je i koncentracija bojila od sto nanomola po litri višestruko povećala oslobađanje peroksida pri svakom ispitanom supstratu i stanju respiracije.

DCFDA donosi još jednu zamku specifičnu za metilensko modrilo. Bojilo je intenzivno obojeno i redoks-aktivno, pa može uzrokovati blijeđenje fluorescencije, gasiti emisiju ili oksidirati sondu neovisno o staničnom ROS-u. Kontrola s bojilom i sondom, ali bez stanica, nije neobvezan ukras. To je pokus koji pokazuje djeluje li bojilo na sondu.

Hvatanje radikala spinskim zamkama i potrošnja kisika: identitet i tok

Dok fluorescentne sonde pokazuju da se pojavilo nešto što može izazvati oksidaciju, elektronska spinska rezonancija sa spinskim zamkama daje izravniji uvid u to što je to bilo. Klasično istraživanje fotokemije metilenskog modrila koristilo je ESR za detekciju askorbatnog radikala uz bojilo, askorbat i svjetlo, a zatim je u pokusima potrošnje kisika pokazalo nastajanje peroksida te u pokusima sa spinskim zamkama stvaranje hidroksilnih radikala katalizirano željezom. Svaka je tehnika odgovorila na pitanje na koje druge nisu mogle: ESR je utvrdio identitet radikala, potrošnja kisika pokazala je reakcijski tok neovisno o bilo kojoj fluorescentnoj sondi, a njihova je kombinacija pokazala da u istom osvijetljenom sustavu djeluju i put singletnog kisika i radikalni putovi.

Taj rezultat iz 1984 i dalje zvuči kao upozorenje. Uz osvjetljenje i prisutnost reducensa bojilo je stvaralo peroksid, a uz prisutnost željeza sustav je proizvodio hidroksilni radikal, najreaktivniju vrstu u toj skupini. Autori su to povezali s askorbatom u oku i doveli u pitanje neselektivnu oftalmološku uporabu. Današnji čitatelji trebaju obratiti pozornost na uvjete: svjetlo uz reducens i željezo. Uklanjanjem bilo kojeg od njih reakcijski put slabi ili nestaje.

Kisikove elektrode opravdavaju svoju ulogu na drugačiji način. Elektroda Clarkova tipa mjeri neto potrošnju kisika, čime se potvrđuje da redoks reakcije koje pokreće bojilo troše molekularni kisik, te daje kinetičke podatke koje nijedan fluorescencijski artefakt ne može oponašati. Ona ne identificira produkt. Nastajanje peroksida, superoksida i vode te raspad singletnog kisika povezani su s potrošnjom kisika. Tok bez identiteta jednako je nepotpun kao identitet bez toka, pa kvalitetni radovi elektrodu kombiniraju s kalibriranim testom peroksida ili zamkom.

Zašto su rezultati o antioksidacijskom djelovanju proturječni

Usporedimo li ta tri očitanja, prividne se proturječnosti u literaturi o metilenskom modrilu razjašnjavaju razlikama u metodama i trima biološkim činjenicama.

Prvo, bojilo istodobno prenosi elektrone i stvara peroksid. Preusmjeravanjem elektrona s mjesta u respiracijskom lancu na kojima bi kisik inače postao superoksid može smanjiti jednu vrstu ROS-a, dok njegov reducirani oblik izravno reducira kisik u peroksid i time povećava drugu. Laboratorij koji proučava mitohondrijske redoks reakcije i ulogu bojila u zaobilaženju respiracijskog lanca zato treba očekivati odgovore koji ovise o sondi: u istoj kiveti očitanje osjetljivo na superoksid pada, dok očitanje peroksida raste.

Drugo, peroksid u niskim dozama predstavlja signal, a ne samo oštećenje. Istraživanje mitohondrija mišjeg mozga koje se nadovezalo na raniji rad utvrdilo je stvaranje peroksida već pri koncentraciji bojila od pedeset nanomola po litri, bez oštećenja mitohondrijske DNA pri terapijskim razinama, uz zaštitu od oštećenja izazvanih rotenonom nakon prethodne obrade. Tek pri sto mikromola po litri, daleko iznad terapijskog raspona, bojilo je oštetilo odabrane fragmente DNA, dok su crveno svjetlo i bojilo u koncentraciji od dvadeset mikromola po litri proizveli singletni kisik koji je oštetio sve ispitane fragmente. Predloženi mehanizam temelji se na hormezi: blago stvaranje peroksida pokreće antioksidacijsku obranu povezanu s Nrf2 i mitohondrijsku biogenezu, pa kratkoročno prooksidacijsko očitanje prethodi dugoročnijem antioksidacijskom ishodu. Očitanje testa nakon jednog sata i očitanje nakon jednog dana mogu se razlikovati jer se biološko stanje u međuvremenu promijenilo.

Treće, svjetlo određuje koja je molekula uopće prisutna. Osvjetljenje demetilira bojilo u smjeru Azure B i srodnih produkata, a već je svjetiljka mikroskopa iznad posude dovoljna da ga fotosenzibilizira. Pokusi u mraku i osvijetljeni pokusi različiti su pokusi, a odjeljak svakog protokola o kontrolama osvjetljenja i rukovanja bojilom treba ih tako i tretirati.

Minimalni skup kontrola i kako tumačiti bilo koju tvrdnju

Usporedba u nastavku izvorni je referentni pregled ovog članka. Prije nego što prihvatite bilo koji rezultat o ROS-u uz metilensko modrilo, provjerite koje su retke autori obuhvatili, a koje preskočili.

Iz toga slijedi praktično pravilo za tumačenje. Kalibrirani Amplex s peroksidazom i provjerom katalazom daje dokaz o peroksidu. DCFDA daje dokaz o nespecifičnoj oksidaciji sonde i ničemu više. Hvatanje radikala spinskim zamkama uz kontrole s hvatačima radikala daje dokaz o identitetu radikala. Potrošnja kisika daje dokaz o toku. Rečenica koja tvrdi više nego što njezin test može potkrijepiti, koliko god samouvjereno bila napisana, govori o sondi, a ne o bojilu. Povezane rasprave o ovisnosti o dozi i hormetičkom rasponu, protoku elektrona u mitohondrijima, ometanju testova u obojenim uzorcima i artefaktima osvjetljenja u mikroskopiji proširuju svaku od tih točaka, a svaka ostaje valjana nakon što se njezina privremena referenca zamijeni.