Mjerenje mitohondrijskih učinaka metilenskog modrila: kisik, ATP i membranski potencijal

Pretpostavimo da laboratorij doda metilensko modrilo mitohondrijima s oštećenom respiracijom i opazi porast potrošnje kisika. Prirodno bi bilo napisati da je bojilo obnovilo mitohondrijsku funkciju. Ta tvrdnja može biti pogrešna. Protok kisika, sinteza ATP-a i membranski potencijal tri su različita pojma. Dijele isti organel kao što sigurnosno kopiranje, sinkronizacija i dijeljenje dijele istu mapu u oblaku: povezani su, ali podliježu različitim pravilima. Zamijenite li jedan drugim, tumačenje postaje pogrešno, čak i kada je svako mjerenje tehnički ispravno.

Metilensko modrilo povećava vjerojatnost takve zabune jer sudjeluje u sustavu koji se mjeri. Ono sudjeluje u redoks-ciklusu, prihvaćajući elektrone u ranijim i predajući ih u kasnijim koracima lanca, lipofilni je kation koji se nakuplja u energiziranim mitohondrijima te intenzivno plav spoj koji apsorbira i emitira svjetlost u istim spektralnim područjima kao uobičajene sonde. Jedan mjerni pokazatelj ne može obuhvatiti sve to. Pouzdan pristup, prikazan u budimpeštanskim istraživanjima mitohondrija, jest mjerenje protoka kisika, brzine sinteze ATP-a, membranskog potencijala i oslobađanja vodikova peroksida, uz kontrole specifične za bojilo u svakom koraku.

Respirometrija mjeri protok kisika, a ne proizvodnju energije

Respirometrija visoke razlučivosti, bilo uređajem Oroboros Oxygraph ili analizatorom izvanstaničnog protoka Seahorse, pokazuje samo jedno: koliko se brzo kisik reducira. Ne pokazuje koliko je protona preneseno po elektronu, koliki je gradijent očuvan ni je li ga ATP-sintaza iskoristila.

Terminologija je važna. U izoliranim mitohondrijima supstrat bez ADP-a daje respiraciju povezanu s propuštanjem protona, supstrat uz zasićujuću koncentraciju ADP-a daje kapacitet oksidativne fosforilacije, a titracija razdvajačem daje maksimalni kapacitet prijenosa elektrona. U intaktnim stanicama odgovarajući pokazatelji uređaja Seahorse jesu bazalna respiracija, respiracija povezana s ATP-om i osjetljiva na oligomicin, propuštanje protona, maksimalna respiracija određena FCCP-om te nemitohondrijska potrošnja kisika otporna na rotenon i antimicin. Nazivanje rezultata uređaja Seahorse stanjem 3 i stanjem 4 pripisuje im preciznost koju takav preparat ne omogućuje, kao što jasno pokazuje okvir testa Agilent Mito Stress Test.

Metilensko modrilo narušava intuitivnu vezu između više kisika i više energije. U izoliranim mitohondrijima mozga zamorca bojilo u koncentraciji od 100 nM do 1 uM povećalo je potrošnju kisika u mirovanju uz supstrate glutamat i malat, sukcinat te alfa-glicerofosfat, uz porast od približno 64 posto na alfa-glicerofosfatu, dok je respiracija potaknuta ADP-om u zdravim mitohondrijima ostala uglavnom nepromijenjena, prema istraživanju izoliranih mitohondrija mozga. Budući da je respiracija povezana s propuštanjem porasla, a protok potaknut ADP-om ostao nepromijenjen, izračunani omjer respiracijske kontrole pada. Taj pad ne znači da je bojilo oštetilo mitohondrije. Znači da je bojilo uz normalnu respiraciju dodalo redoks-ciklus koji troši kisik. Test potrošnje kisika uz metilensko modrilo koji bilježi samo porast izmjerio je stvarnu kemijsku reakciju, ali nije rekao ništa o očuvanju energije.

Pokusi obnove funkcije pokazuju isti raskorak u većem opsegu. Uz blokiran kompleks I, protok kisika povećao se približno trostruko, dok se sinteza ATP-a povećala tek približno 1.5 puta. Više je kisika stiglo do elektrode. Manji dio tog kisika pridonio je proizvodnji ATP-a. Svaka tvrdnja o poboljšanoj oksidativnoj fosforilaciji mora uključivati i mjerenje ATP-a, po mogućnosti izraženo kao omjer ATP-a i kisika uz navedenu konvenciju nazivnika.

Testovi ATP-a mjere brzinu sinteze, koju sadržaj ne može zamijeniti

Test ATP-a odgovara na drugo pitanje: koliko ATP-a nastaje u jedinici vremena. Kinetičko mjerenje, bilo praćenjem luminiscencije luciferaze krijesnice tijekom nekoliko minuta ili spregnutim testom s heksokinazom i glukoza-6-fosfat-dehidrogenazom pri 340 nm, daje brzinu. Jednokratno mjerenje ukupnog ATP-a na završnoj točki daje sadržaj, koji odražava sintezu umanjenu za potrošnju i sam po sebi malo govori o oksidativnoj fosforilaciji.

Budimpeštanska skupina upotrijebila je spregnutu enzimsku metodu uz inhibiranu adenilat-kinazu i utvrdila da metilensko modrilo u koncentraciji od 1 do 2 uM umjereno, ali značajno povećava proizvodnju ATP-a u mitohondrijima tretiranima rotenonom i antimicinom. To je stvarna, ali djelomična obnova funkcije. Istraživanje toksičnosti TEGDMA-e dalo je sličan rezultat u drugom modelu: 5 mM dentalnog monomera TEGDMA smanjilo je respiraciju povezanu s kompleksom I s približno 286 na 28 jedinica protoka, a 2 uM bojila povećalo ju je na približno 86.

Kod obojenog redoks-spoja dvije su kontrole obvezne. Prvo, provedite mjerenje uz oligomicin kako biste utvrdili koliki dio izmjerene sinteze ATP-a ovisi o ATP-sintazi. Drugo, provedite provjeru iskorištenja dodanog ATP-a u sustavu bez stanica, s poznatom količinom ATP-a, potpunim reagensom i točno onim koncentracijama bojila koje se koriste, najmanje 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM i 2 uM. Bojilo može apsorbirati emitiranu svjetlost, inhibirati reporterski enzim ili promijeniti redoks-kemiju reagensa, a opće smjernice za testove luciferaze preporučuju biokemijske protutestove upravo za ovu vrstu interferencije. Nemojte pretpostaviti da pri 1 uM nema artefakata samo zato što je gašenje fluorescencije obično izraženije pri višim koncentracijama.

Sonde za membranski potencijal mjere raspodjelu bojila, a ne protok

Safranin O, TMRM i TMRE, rodamin 123 i JC-1 kationi su koji prolaze kroz membranu. Nakupljaju se u negativno nabijenom matriksu prema elektrokemijskoj ravnoteži, pa ukupna fluorescencija neizravno pokazuje potencijal preko raspodjele sonde. Nijedna od njih ne mjeri ATP ni protok elektrona.

Svaka sonda ima preparat za koji je najprikladnija. Safranin O prikladan je za izolirane mitohondrije i permeabilizirane stanice, obično pri približno 2 uM, uz pobudu oko 495 nm i emisiju oko 585 nm, u režimu gašenja fluorescencije u kojem unos sonde mijenja ukupnu fluorescenciju. TMRM i TMRE prikladni su za intaktne stanice pri niskim nanomolarnim koncentracijama bez gašenja fluorescencije, kada depolarizacija oslobađa bojilo, a mitohondrijska fluorescencija pada; pri visokim koncentracijama smjer signala može se preokrenuti zbog samogašenja. JC-1 daje praktičan omjer zelenog i crvenog signala, ali ovisi o količini unesene sonde i mitohondrijskoj masi, zbog čega je slabiji izbor za kvantitativni rad od pažljivo kontroliranog TMRM-a. Ti su kompromisi sažeti u široko korištenom preglednom radu o sondama za mitohondrijski membranski potencijal.

Metilensko modrilo uzrokuje optičku interferenciju upravo pri radnim koncentracijama. Njegove apsorpcijske vrpce u području od približno 600 do 665 nm preklapaju se s crvenom emisijom sondi, pa su učinci unutarnjeg filtra, gašenje fluorescencije i apsorpcija pobudne svjetlosti svi mogući. Bojilo je ujedno drugi lipofilni kation čija se raspodjela mijenja s potencijalom koji se mjeri. Zaštita je uporaba više mjernih pristupa uz slijepe probe: samo sonda, samo bojilo, sonda sa svakom koncentracijom bojila, potpuna depolarizacija FCCP-om kao nulta referenca i, idealno, druga optički različita sonda. Istraživanje zaobilaženja kompleksa III postavilo je taj presedan ponavljanjem mjerenja obnove membranskog potencijala i sa safraninom O i s TMRM-om nakon inhibicije antimicinom i miksotiazolom, uz jednaku kvalitativnu obnovu. Jedan optički reporter daje naznaku. Dva neovisna reportera daju dokaz.

Tri preparata, tri različita pitanja

Izolirani mitohondriji, permeabilizirane stanice i intaktne stanice nisu zamjenjive postavke osjetljivosti iste metode. To su različiti pristupi s različitim načelima rada.

Izolirani mitohondriji zadržavaju lanac prijenosa elektrona, unutarnju membranu i funkcionalni sustav matriksa, dok se plazmatska membrana, citosol i arhitektura mreže uklanjaju. Upravo je to uklanjanje svrha: supstrati, ADP, inhibitori i koncentracije bojila točno su definirani, pa se može utvrditi odgovarajući put. Cijena je gubitak prirodne opskrbe supstratima, signalizacije i energetskih potreba.

Permeabilizirane stanice zadržavaju mitohondrije unutar većeg dijela stanične arhitekture, a egzogeni supstrati i ADP prolaze kroz otvorenu plazmatsku membranu. One su prikladan alat za utvrđivanje poremećaja određenog supstratnog puta u staničnom kontekstu. Prekomjerna permeabilizacija oštećuje vanjsku membranu, a citosolna regulacija gubi se ispiranjem.

Intaktne stanice zadržavaju sve: barijeru plazmatske membrane, citosolne reducense, transport endogenih supstrata, mitohondrijsku mrežu i potrebe za ATP-om. Najbliže su fiziologiji, a najudaljenije od izravnog razjašnjenja mehanizma jer unos, redukcija i sekvestracija bojila zajedno oblikuju stvarnu izloženost mitohondrija.

Istraživanje TEGDMA-e namjerno je koristilo sve tri razine: izolirane mitohondrije mozga za obnovu oksidacije i potencijala bojilom, permeabilizirane matične stanice zubne pulpe ponajprije za lokalizaciju poremećaja na oksidaciju supstrata povezanu s kompleksom I te intaktne matične stanice za fiziološki neto učinak 2 uM bojila na smanjenu potrošnju kisika. Čitateljima koji uspoređuju mitohondrijska mjerenja u različitim preparatima popratni članak o tome kako metilensko modrilo prenosi elektrone kroz respiracijski lanac daje pozadinu o tim putovima, a vodič za čitanje istraživanja respiracije uz metilensko modrilo objašnjava logiku koncentracija i inhibitora.

Kontrole koje zahtijeva redoks-aktivno bojilo

Spoj koji sudjeluje u redoks-ciklusu zahtijeva dulji popis kontrola od običnog inhibitora jer kemijske reakcije samog bojila mogu oponašati biološke procese.

Za respirometriju provedite mjerenje u komori samo s puferom radi provjere pomaka signala, u komori s puferom i bojilom bez biološkog materijala, s bojilom i svakim izvanstaničnim reducensom prisutnim u testu te uz završni dodatak rotenona i antimicina radi određivanja nemitohondrijske potrošnje kisika u intaktnim stanicama. Imajte na umu da se reducirano bojilo ponovno oksidira prijenosom elektrona na kisik uz nastanak vodikova peroksida, pa slijepa proba samo s bojilom, bez donora elektrona, podcjenjuje potrošnju kisika u sustavu bez stanica koja nastaje kada su dostupni NADH ili NADPH.

Za vodikov peroksid prednost dajte kalibriranom testu s Amplex UltraRed i peroksidazom hrena u odnosu na neselektivna bojila DCFDA, potvrdite rezultat katalazom i ispitajte ovisnost o osvjetljenju jer je bojilo fotosenzibilizator. Istraživanje mitohondrija mozga utvrdilo je da je opterećenje peroksidom poraslo više nego četverostruko već pri 100 nM bojila, dok se njegovo uklanjanje usporilo, pri čemu je peroksid nastajao izravno djelovanjem reduciranog bojila bez superoksidnog međuprodukta. Pojedinosti o odabiru sondi i kontrolama osvjetljenja obrađene su u popratnom članku o mjerenju reaktivnih kisikovih vrsta u pokusima s bojilima, a šire pitanje kada peroksid djeluje kao signal, a kada kao opterećenje obrađeno je uz staničnu redoks-ravnotežu i tvrdnje o antioksidativnom djelovanju.

Za tvrdnje o putovima ispitajte oba mjesta inhibicije kompleksa III: antimicin A na mjestu Qi i miksotiazol na mjestu Qo, uz završnu provjeru kompleksa IV cijanidom. Ranije istraživanje mozga miša izvijestilo je o obnovi respiracije blokirane rotenonom, ali ne i one blokirane antimicinom, dok je kasnije istraživanje na trima vrstama utvrdilo djelomičnu obnovu uz oba inhibitora i dokaze izravne redukcije citokroma c. Zaobilaženje smatrajte tumačenjem usklađenim s novijim podacima, a ne konačno utvrđenim mehanizmom, jer koncentracija bojila, mjesto djelovanja inhibitora, stanje supstrata i raspodjela bojila mijenjaju opaženi put.

Matrica odabira metoda mjerenja

Ovom tablicom odaberite mjerenje prema pitanju, a ne obrnuto.

Minimalno uvjerljiva tvrdnja zahtijeva ispitivanje istih koncentracija bojila, 100 nM, 300 nM, 1 uM i 2 uM, mjerenjem protoka kisika u uvjetima propuštanja protona, uz ADP, oligomicin i razdvajač, brzine sinteze ATP-a, membranskog potencijala po mogućnosti dvjema sondama te kalibriranog oslobađanja peroksida uz katalazu i kontrole bez stanica. Prikažite povezani skup rezultata: protok kisika, brzinu sinteze ATP-a, ATP po kisiku, potencijal i peroksid. Bilo koji od tih brojeva sam za sebe mjerenje je koje tek traži značenje.