Metilensko modrilo, Nrf2 i biogeneza mitohondrija: što je izmjereno, a što je još uvijek pretpostavka

U tekstovima o metilenskom modrilu često se pojavljuje jedna rečenica: ono aktivira Nrf2 i stvara nove mitohondrije. Rečenica zvuči kao jedna tvrdnja, ali sadrži dva različita pojma, proučavana u različitim sustavima, uz različite vrste dokaza. Prvi je signalni put, senzor koji uključuje obrambene gene. Drugi je program izgradnje, kojim stanica stvara dodatnu mitohondrijsku mašineriju. Signal može pokrenuti izgradnju, ali pokazati da je signal aktiviran nije isto što i pokazati da je zgrada podignuta, a pokazati da ima više građevnog materijala nije isto što i pokazati bolju opskrbu energijom. Ovaj članak razdvaja te tri stvari.

Pojam Nrf2: senzor, a ne štit

Nrf2 (nuklearni faktor 2 povezan s eritroidnim faktorom 2) transkripcijski je faktor, protein čija je zadaća uključivati gene. U stanju mirovanja u citoplazmi ga zadržava senzorski protein nazvan Keap1, koji ga predaje staničnom sustavu za razgradnju radi neprekidnog uništavanja. Kada oksidansi ili elektrofili modificiraju reaktivne cisteine na proteinu Keap1, razgradnja prestaje. Novonastali Nrf2 nakuplja se, prelazi u jezgru, udružuje se s malim proteinima Maf i veže se na sekvence DNA koje se nazivaju elementi antioksidacijskog odgovora. To vezanje uključuje niz obrambenih gena.

Kanonski pokazatelji ovog puta specifični su. NQO1 (NAD(P)H kinon dehidrogenaza 1) i TrxR1 (tioredoksin reduktaza 1) među najpouzdanijim su ciljnim genima Nrf2. HO-1 (hem oksigenaza-1) može se snažno inducirati, ali reagira i na druge regulatore. Enzimi poput SOD-a i katalaze dio su antioksidacijske mašinerije, no njihove razine kontroliraju brojni transkripcijski faktori, pa porast SOD-a sam po sebi ne dokazuje da je uzrok bio Nrf2. Dokaz najbliži samom signalnom događaju jest nakupljanje Nrf2 u jezgri, aktivacija reporterskog sustava ARE ili indukcija kanonskih ciljnih gena koja nestaje kada se Nrf2 ukloni. Sve ostalo, niže razine oksidansa, bolje preživljavanje pod stresom, više glutationa, nizvodni su učinci koje mogu proizvesti brojni putovi.

Najraniji rezultat s metilenskim modrilom u ovoj priči nalazi se bliže tom signalnom događaju na opisanoj ljestvici dokaza. Fibroblasti izloženi nanomolarnim koncentracijama metilenskog modrila pokazali su odgođenu senescenciju uz veći sadržaj kompleksa IV, veću potrošnju kisika i indukciju enzima faze 2, TrxR1 i NQO1, kako je opisano u istraživanju koje je prvo povezalo metilensko modrilo s poboljšanjem mitohondrijske funkcije i odgađanjem senescencije. TrxR1 i NQO1 upravo su kanonski ciljni geni Nrf2 koje pažljiv čitatelj želi vidjeti. Ono što istraživanje nije pokazalo jest sam signalni događaj: nije bilo mjerenja Nrf2 u jezgri, reporterskog sustava ARE ni kontrole s isključenim genom Nrf2. Stoga je pošteno tumačenje da metilensko modrilo u tom sustavu inducira poznate ciljne gene Nrf2, što je u skladu s aktivacijom Nrf2, ali ne izdvaja Nrf2 kao uzrok. Indukcija ciljnog gena nalazi se jedan korak nizvodno od prekidača.

Pojam biogeneze: program s tri kontrolne točke

Biogeneza mitohondrija program je kojim stanica povećava svoj mitohondrijski kapacitet. Njezina udžbenička hijerarhija prolazi kroz tri kontrolne točke. Prvo, koaktivator PGC-1alpha uključuje program. Drugo, nuklearni transkripcijski faktori (zbunjujuće, jedan se zove NRF1, nuklearni respiracijski faktor 1, protein različit od Nrf2) potiču ekspresiju mitohondrijskih gena, uključujući TFAM, koji održava i umnaža mitohondrijsku DNA. Treće, stanica na kraju ima više mitohondrijskih genoma i više respiracijske mašinerije, što se može mjeriti brojem kopija mtDNA, aktivnošću citrat sintaze ili količinom i aktivnošću respiracijskih kompleksa.

Svaka kontrolna točka daje slabiju ili jaču osnovu za tvrdnju od prethodne. Više glasničke RNA za PGC-1alpha ili TFAM pokazuje da je zatraženo pokretanje programa, a ne da je on dovršen. Više mtDNA ili više proteina kompleksa IV pokazuje da ima više materijala, ali i preoblikovani mitohondriji mogu izgledati jednako. Bolja respiracija, veća potrošnja kisika ili veća aktivnost kompleksa pokazuju da se funkcija promijenila, ali funkcija se može poboljšati i bez ijednog novog mitohondrija. Čvrsta tvrdnja o biogenezi objedinjuje sve troje: regulator, sadržaj i funkciju.

Naknadno istraživanje na fibroblastima obuhvatilo je većinu tog slijeda. U ljudskim stanicama IMR90 tretiranima metilenskim modrilom u koncentraciji od 100 nanomola, omjer NAD-a i NADH-a prolazno je porastao unutar 15 minuta i vratio se na početnu razinu unutar jednog dana. Nakon tog prolaznog energetskog signala uslijedila je prolazna fosforilacija energetskog senzora AMPK, a zatim indukcija PGC-1alpha i SURF1, proteina potrebnog za sastavljanje funkcionalnog kompleksa IV. Aktivnost kompleksa IV približno se udvostručila, stanični oksidansi smanjili su se za oko 28 posto, a telomere su se sporije skraćivale. Cijeli je slijed prikazan u radu koji povezuje redoks-aktivnost metilenskog modrila s AMPK i biogenezom mitohondrija.

Dvije pojedinosti iz tog rada zaslužuju pozornost jer se upravo takve pojedinosti obično izostavljaju. Prvo, obrazac je bio važniji od same prisutnosti: metilensko modrilo prolazno je aktiviralo AMPK, dok ga je usporedni lijek AICAR aktivirao kronično, a prolazni aktivator odgodio je senescenciju oko osam puta učinkovitije. Tvrdnja poput „metilensko modrilo aktivira AMPK” stoga je nepotpuna; ključna je tvrdnja da AMPK aktivira prolazno, a usporedba upućuje na to da kronična aktivacija ne postiže isto. Drugo, metilensko modrilo nije promijenilo stanični ciklus, čime se isključuje najjednostavnije alternativno objašnjenje: da su se stanice samo sporije dijelile i zbog toga izgledale mlađe.

Istraživanja na miševima: ponašanje, genomi i namjerno paradoksalan okidač

Rad na staničnim kulturama proširila je na životinje skupina koja je proučavala miševe srednje dobi. Nakon 60 dana oralne primjene metilenskog modrila, tretirani miševi zadržali su više fizičke izdržljivosti i istraživačkog ponašanja te pokazali manje ponašanja nalik anksioznosti od netretiranih ostarjelih miševa. U moždanom tkivu ekspresija gena koju je starenje potisnulo, NRF1, TFAM, SOD2 i podjedinice kompleksa IV COX1, vratila se prema razinama u odrasloj dobi, a broj kopija mtDNA porastao je. Ti rezultati, koji obuhvaćaju ponašanje, regulator i količinu genoma, opisani su u istraživanju metilenskog modrila i biogeneze mitohondrija u mozgu miševa srednje dobi.

Zanimljiv dio jest predloženi okidač jer se protivi jednostavnoj priči da je metilensko modrilo antioksidans. Tretirani miševi pokazali su povećano stvaranje reaktivnih kisikovih vrsta u mitohondrijima mozga, konkretno vodikova peroksida. Autori su predložili sljedeće objašnjenje: blag peroksidni signal aktivira put Nrf2, koji zatim pokreće program biogeneze. U tom je modelu metilensko modrilo prooksidans u koraku pokretanja, a antioksidans u koraku ishoda, što je obrazac koji farmakolozi nazivaju hormezom, pri kojoj blag stres izaziva obranu veću od samog stresa. Uzrokuje li taj porast peroksida doista aktivaciju Nrf2 nije izravno ispitano; riječ je o pretpostavljenoj vezi, a ne o izmjerenoj povezanosti.

Popratno istraživanje iste skupine podvrgnulo je sigurnosnu stranu te pretpostavke strožoj provjeri. U izoliranim mitohondrijima mozga metilensko modrilo povećalo je proizvodnju vodikova peroksida već pri koncentracijama od 50 nanomola, no terapijske koncentracije nisu uzrokovale mjerljivo oštećenje mitohondrijske DNA. Tek pri koncentraciji od 100 mikromola, daleko iznad terapijskih razina, odabrani fragmenti mtDNA pokazali su oštećenja, a kombinacija bojila u koncentraciji od 20 mikromola s crvenim svjetlom proizvela je singletni kisik koji je oštetio mtDNA na mnogim mjestima, što je poznato fotosenzibilizacijsko djelovanje bojila, a ne njegova farmakologija u mraku. Prethodni tretman čak je zaštitio mitohondrije ventralnog srednjeg mozga od lezija mtDNA izazvanih rotenonom. Odgovor ovisan o dozi i kontrole genotoksičnosti detaljno su opisani u istraživanju negenotoksične proizvodnje peroksida potaknute metilenskim modrilom.

Izmjereno nasuprot pretpostavljenom: tumačenje dijagrama

Dijagram puta u nastavku izrađen je za ovaj članak kako bi naglasio razliku koju tekst dosljedno ističe. Okviri s punim obrubima prikazuju korake s izravnom eksperimentalnom potporom u literaturi o metilenskom modrilu: redoks-kruženje koje mijenja NAD/NADH, prolaznu fosforilaciju AMPK, indukciju PGC-1alpha i SURF1, veću aktivnost kompleksa IV, indukciju NQO1 i TrxR1, obnovljenu ekspresiju gena biogeneze i broj kopija mtDNA u mozgu miševa te porast peroksida bez oštećenja mtDNA pri terapijskim dozama. Okviri s isprekidanim obrubima prikazuju pretpostavljene veze: Keap1 koji prepoznaje peroksidni signal, nakupljanje Nrf2 u jezgri koje pokreće obrambene gene i uzročnu strelicu od aktivacije Nrf2 do programa biogeneze. Ti su isprekidani koraci uvjerljivi, u skladu s podacima i standardnom udžbeničkom biologijom, ali u tim radovima nisu mjereni uz kontrole (Nrf2 u jezgri, reporterski sustavi ARE, isključivanje gena Nrf2) koje bi ih pretvorile u okvire s punim obrubima.

Kada je dijagram pred vama, postaju vidljive tri zabune. Prvo, NRF1 i Nrf2 različiti su proteini s gotovo identičnim nazivima; istraživanje na miševima mjerilo je nuklearni respiracijski faktor 1, regulator biogeneze, a ne antioksidacijski transkripcijski faktor, i njihovo poistovjećivanje svodi cijeli dijagram na jedan čvor. Drugo, ekspresija gena početak je priče, a ne njezin kraj; obnovljene razine glasničke RNA za TFAM ili COX1 podupiru zaključak da je zatražena biogeneza, dok su broj kopija mtDNA i aktivnost kompleksa IV dokaz da je zahtjev ispunjen. Treće, antioksidacijski ishod ne dokazuje da se sve odvijalo putem Nrf2; smanjenje oksidansa od 28 posto u fibroblastima i zaštita od rotenona u miševa stvarni su nizvodni učinci, ali do njih vodi više putova.

Što bi isprekidani okvir pretvorilo u puni

Pokusi koji nedostaju standardni su. Mjerenje proteina Nrf2 u jezgri nakon izlaganja metilenskom modrilu, uz vremenski tijek usklađen s prolaznim signalom AMPK, ispitalo bi aktiviraju li se te dvije grane doista istodobno, kako tvrdi hipoteza sinkronizirane aktivacije. Reporterski sustav kojim upravlja ARE potvrdio bi transkripcijsku aktivnost umjesto da se ona zaključuje iz ciljnih gena. Ponavljanje mjerenja pokazatelja biogeneze uz utišan ili isključen gen Nrf2 izravno bi ispitalo uzročnu strelicu: ako se indukcija kompleksa IV i porast mtDNA zadrže bez Nrf2, pretpostavljena veza nije točna i grana AMPK sama nosi učinak. U životinja bi istraživanje kronične primjene s istim trima kontrolnim točkama, regulatorom, sadržajem i funkcijom, ispitalo ostaje li program uključen ili se prilagođava. Do tada sinkronizirana aktivacija energetskih i obrambenih putova ostaje ono kako su je autori nazvali: mogući ključni čimbenik, a ne utvrđen mehanizam.

Čitatelje koji dolaze iz šireg područja farmakologije mogao bi zanimati okolni kontekst: kako metilensko modrilo prenosi elektrone na mitohondrijskoj razini, što još čini mitohondrijima i staničnoj energiji, gdje se nalazi o senescenciji uklapaju u istraživanja starenja, kako se tvrdnje o biogenezi odnose prema kognitivnoj izvedbi te sigurnosni podaci koji određuju granice svake rasprave o doziranju. Svaka od tih tema zaseban je pojam s vlastitim dokazima i svaka zaslužuje isto razgraničenje izmjerenog i pretpostavljenog koje je ovaj članak primijenio na Nrf2.