Metilensko modrilo i neurotransmiteri: serotonin, dopamin, GABA i acetilkolin

Često se za metilensko modrilo kaže da istodobno povisuje serotonin, povisuje dopamin, smiruje GABA-u i pojačava djelovanje acetilkolina. Takva tvrdnja četiri odvojena laboratorijska nalaza prikazuje kao jedan učinak u ljudskom organizmu. Radovi na kojima se temelji mjerili su različite mete, u različitim pripravcima, pri koncentracijama koje se razlikuju za faktor od približno tisuću. Kada se mete razdvoje, slika postaje i zanimljivija i opreznija nego što ta jedna rečenica sugerira.

Osnovna je ideja jednostavna. Molekula koja se veže za enzim u epruveti učinila je jednu stvar: vezala se za enzim u epruveti. Hoće li to promijeniti razinu neurotransmitera u živom mozgu ovisi o koncentraciji koja dospije do tkiva, o kemijskom obliku molekule pri dolasku i o svim njezinim drugim djelovanjima pri istoj koncentraciji. Svaki odjeljak u nastavku povezuje ta tri pitanja s nalazom na koji se odnose.

Serotonin: dvije mete, dvije koncentracije

Od četiri sustava, za serotonin postoje najčvršći dokazi, a proizlaze iz dviju različitih molekularnih meta koje ne treba poistovjećivati.

Prva je meta monoaminooksidaza tipa A, mitohondrijski enzim koji razgrađuje serotonin. Metilensko modrilo inhibira pročišćenu ljudsku MAO-A kao inhibitor s čvrstim vezanjem, uz Ki od približno 27 nanomola, dok su za djelovanje na MAO-B potrebne mnogo više koncentracije, kako je pokazano u kinetičkom istraživanju koje je povezalo bojilo sa serotoninskom toksičnošću. Povezana istraživanja utvrdila su istu selektivnost u tkivu epifize štakora, gdje je blokada MAO-A povisila razine indola nastalih iz serotonina, snizila razinu serotoninskog metabolita 5-HIAA i promijenila refleks uspravljanja povezan sa serotoninom u žaba, što je opisano u istraživanju redoks-bojila i indola epifize. Dva različita pripravka, isti smjer djelovanja: manje razgradnje i više zadržanog serotonina ondje gdje bi ga enzim inače uklonio.

Druga je meta sam serotoninski transporter. U stanicama koje eksprimiraju ljudski transporter metilensko modrilo smanjilo je unos i fluorescentnog supstrata i obilježenog serotonina uz IC50 od približno 1.4 mikromola te potisnulo struje izazvane serotoninom u mjerenjima tehnikom patch-clamp, prema izravnoj karakterizaciji djelovanja metilenskog modrila na SERT. Autori su provjerili očita alternativna objašnjenja i utvrdili da učinak ne ovisi o signalizaciji putem cGMP-a, promjenama kalcija ni ekspresiji transportera na površini stanice.

Obratite pozornost na razliku između tih dviju vrijednosti. Inhibicija MAO-A događa se u nanomolarnom rasponu. Za inhibiciju transportera potrebno je približno pedeset puta više bojila. Niska izloženost koja potpuno djeluje na enzim može jedva utjecati na transporter. Svatko tko te nalaze spaja u jednu tvrdnju o serotoninu svodi dva različita raspona doza na jedan.

Je li bilo koja od tih meta važna kod osobe koja uzima druge serotonergičke lijekove pitanje je primjene lijekova i pripada vodiču o interakcijama lijekova. Ovaj članak prikazuje mete; klinički savjeti nalaze se na toj stranici.

Dopamin: najslabiji izravni dokazi

Kod dopamina znanstvena poštenost zahtijeva najveću suzdržanost. Ne postoji dobro potvrđeno istraživanje koje pokazuje da metilensko modrilo blokira dopaminski transporter ili se izravno veže za dopaminske receptore. Često navođena vrijednost IC50 transportera od 1.4 mikromola odnosi se na serotoninski transporter, a ne na DAT, i nikada je ne treba pripisivati drugoj meti.

Postojeći su dokazi neizravni. Budući da enzimi MAO metaboliziraju i dopamin, inhibicija MAO-a čuva dopamin zajedno sa serotoninom i noradrenalinom. U mitohondrijskim pripravcima metilensko modrilo blokiralo je pretvorbu neurotoksina MPTP u njegov dopaminergički otrov posredovanu MAO-B-om, uz potentnost usporedivu s deprenilom, lijekom za Parkinsonovu bolest, kako opisuju istraživanje bioaktivacije MPTP-a i povezani radovi o MAO-B-u. Istraživanja na životinjama dodaju djelomične nalaze: približno trostruko povećanje bazalnog otpuštanja dopamina iz presjeka strijatuma štakora pri 10 mikromola, proučavano u kontekstu signalizacije dušikovim monoksidom, a ne blokade transportera, te neujednačene rezultate po regijama nakon sistemske primjene, pri čemu su neka istraživanja utvrdila porast serotonina i noradrenalina, dok se dopamin gotovo nije promijenio.

Dakle, nalazi o dopaminu postoje, ali su neizravni. Djelovanje se odvija putem enzima koji obrađuje više monoamina istodobno, a ne putem mete specifične za dopamin. Svaka tvrdnja da metilensko modrilo povisuje dopamin u ljudi preskače korak u kojem bi to doista trebalo pokazati.

GABA: blokiranje kočnice u veznom džepu

Nalaz o GABA-i precizan je i proturječi reputaciji tog bojila. U stanicama koje eksprimiraju ljudske receptore GABA-A metilensko modrilo inhibiralo je struje izazvane GABA-om počevši od približno 3 mikromola, uz IC50 od približno 31 mikromola za čestu konfiguraciju alpha1-beta2-gamma2, prema elektrofiziološkom istraživanju koje je utvrdilo mjesto djelovanja.

Utvrđivanje mjesta djelovanja vrijedan je dio nalaza. Mutacije na mjestu vezanja pikrotoksina nisu promijenile inhibiciju, a mjesta vezanja benzodiazepina i cinka isključena su usporedbama podjedinica. Nasuprot tomu, mutacije na dvama aminokiselinskim ostatcima za koje je poznato da tvore sam vezni džep za GABA-u znatno su smanjile blokadu, što upućuje na kompetitivni antagonizam na mjestu vezanja agonista, a ne na alosteričku modulaciju drugdje. Učinak je bio prisutan u različitim kombinacijama sinaptičkih i ekstrasinaptičkih podjedinica te je brzo nestajao nakon ispiranja.

To stvara stvarno proturječje koje vrijedi jasno istaknuti. Molekula koja se istražuje za potporu pamćenju ujedno potiskuje brzi inhibicijski prijenos u laboratorijskoj posudi. Događa li se takvo potiskivanje u živom mozgu ovisi o lokalnoj koncentraciji, a 31 mikromol visoka je vrijednost u odnosu na većinu sistemskih izloženosti, o čemu govori završni odjeljak. Samo je proturječje nalaz; za njegovo razrješenje bili bi potrebni pokusi koje nitko nije proveo.

Acetilkolin: dvije suprotstavljene mete

Za acetilkolin postoje dva nalaza koja upućuju u suprotnim smjerovima, zbog čega ih i treba prikazati odvojeno.

S jedne strane, metilensko modrilo inhibira enzime koji uklanjaju acetilkolin. Acetilkolinesteraza iz eritrocita krave kompetitivno je inhibirana pri približno 0.57 mikromola, goveđi enzim pri približno 0.42 mikromola, a esterazna aktivnost u ljudskoj plazmi pri približno 1.1 mikromola, dok je butirilkolinesteraza inhibirana u rasponu od približno 0.4 do 5.3 mikromola, ovisno o vrsti i pripravku, kako sažima pregled djelovanja metilenskog modrila u živčanom sustavu. Usporavanje uklanjanja ostavlja više neurotransmitera u sinapsi, što je ista logika na kojoj se temelji nekoliko odobrenih lijekova za Alzheimerovu bolest.

No kemijsko djelovanje ima uvjet. Oksidirani plavi oblik inhibira enzim; reducirani bezbojni oblik ne inhibira ga, a u dugim inkubacijama koje omogućuju redukciju bojila bilježi se slabija inhibicija već samo zbog toga. Svaka brojčana vrijednost dobivena mjerenjem kolinesteraze uključuje nevidljivu varijablu: koliko je bojila još bilo plavo u trenutku mjerenja.

S druge strane, metilensko modrilo blokira nikotinski receptor alpha7, jedan od receptora na koje acetilkolin djeluje. Ljudski receptori alpha7 eksprimirani u oocitama žaba inhibirani su uz IC50 od približno 3.4 mikromola putem nekompetitivnog antagonizma neovisnog o naponu, koji nije promijenio potentnost agonista, a 3 mikromola ukinula su sinaptičke odgovore potaknute kolinom u presjecima hipokampusa štakora, kako navodi istraživanje receptora alpha7. Dakle, pri sličnim niskim mikromolarnim koncentracijama bojilo istodobno čuva neurotransmiter i prigušuje jedan od njegovih receptora. Ukupni učinak na kolinergičku signalizaciju ne može se zaključiti iz bilo kojeg od tih nalaza zasebno. Ta je nejasnoća povezana sa širom literaturom o Alzheimerovoj bolesti i s povezanom raspravom o istraživanjima kognicije i bolesti, ali ovdje ostaje nerazriješena.

Usporedba na jednom mjestu

Najosjetljiviju i najmanje osjetljivu metu razdvajaju tri reda veličine. Taj raspon sažima članak u jednoj tablici.

Dosežu li te koncentracije mozak?

Vrijednost iz epruvete ne znači ništa bez vrijednosti izloženosti uz nju. Nakon intravenskog bolusa od približno 1.4 mg po kg zabilježene su srednje razine u ljudskoj plazmi od približno 5 mikromola, dok je oralna doza od 100 mg proizvela razine u punoj krvi od približno 0.08 mikromola, prema istom skupu literature. Istraživanja raspodjele u štakora utvrđuju razine u mozgu približno deset do dvadeset puta više od cirkulirajućih razina, no riječ je o ukupnom bojilu u homogeniziranom tkivu, a ne o slobodnom oksidiranom bojilu u sinapsi; vezanje za proteine plazme od približno 94 posto te raspodjela u krvne stanice dodatno smanjuju slobodnu frakciju.

U usporedbi s tablicom, obrazac je stupnjevit, a ne binaran. Inhibicija MAO-A događa se znatno ispod tipičnih intravenskih izloženosti i farmakološki je vjerojatna kad god se bojilo primjenjuje tim putem. Učinci na kolinesterazu i alpha7 nalaze se u niskom mikromolarnom rasponu koji se preklapa s vršnim koncentracijama nakon intravenske primjene, ali koji uobičajene oralne doze možda ne dosežu. IC50 za GABA-A od 31 mikromola iznad je većine vjerojatnih sistemskih izloženosti, zbog čega je upravo tu blokadu najteže pretpostaviti u cijelom ljudskom organizmu. Svaki redak ove usporedbe zahtijeva istu ogradu: relevantna je koncentracija slobodnog, oksidiranog, izvanstaničnog bojila na ciljnom mjestu, a tu veličinu nijedan uzorak krvi ne mjeri izravno.

Što ne treba zaključiti

Nijedan redak tablice ne dokazuje da metilensko modrilo predvidljivo povisuje ili snižava razinu bilo kojeg neurotransmitera u čovjeku. Inhibicija enzima u pročišćenom pripravku, blokada transportera u staničnoj liniji i antagonizam receptora u presjeku tkiva svaki su po jedan kontrolirani korak udaljeni od stvarnosti u sinapsi, a odjeljak o kolinergičkom sustavu pokazuje kako dva točna nalaza zajedno ostavljaju neizvjestan ukupni ishod. Ovu stranicu odgovorno je koristiti kao prikaz meta za koje je dokazano da na njih molekula djeluje, uz označenu jačinu djelovanja, kako bi rasprava o mehanizmima ostala utemeljena na onome što je doista izmjereno. Za interakcije tih meta s propisanim lijekovima mjerodavna je stranica vodiča o interakcijama, uz dodatni kontekst u osnovama farmakologije i pratećem objašnjenju mehanizama.