Metilensko modrilo i masna jetra: što su pokazala eksperimentalna istraživanja

Masna jetra jedan je naziv za nekoliko različitih problema. Kod jedne osobe okidač je dugotrajna prekomjerna konzumacija alkohola. Kod druge je to prekomjeran unos hranjivih tvari uz inzulinsku rezistenciju i povećanu dopremu masti u jetru. Pod mikroskopom se u oba slučaja može vidjeti jednostavno nakupljanje masti, ali početni uzroci razlikuju se. Ta razlika određuje što pojedini eksperiment može dokazati.

Literatura o metilenskom modrilu i masnoj jetri oskudna je i u vezi s tim pitanjem u potpunosti pretklinička. Najčešće se citiraju tri istraživanja na štakorima i miševima, a njihovi rezultati ne upućuju svi u istom smjeru. Jedno istraživanje s unosom etanola ispravilo je redoks promjenu, ali nije promijenilo količinu masti u jetri. Jedno istraživanje prehrane bogate mastima smanjilo je mast u jetri uz promjenu signalizacije. Jedno istraživanje na zdravim životinjama pokazalo je suprotne rezultate lipidne peroksidacije u jetri i bubregu. Promatrana zajedno, ta istraživanja pokazuju zašto tri ishoda treba držati odvojenima: redoks promjenu, aktivaciju signalizacije i nakupljanje masti u tkivu.

Tri ishoda koja je lako zamijeniti

Redoks pokazatelj opisuje prijenos elektrona. Omjer NAD+ i NADH u jetri pokazuje je li stanično okruženje razmjerno oksidirano ili reducirano. Oksidacija etanola pretvara NAD+ u NADH, pa kronična konzumacija alkohola snižava taj omjer. Bojilo koje prihvaća elektrone može ga ponovno povisiti. To je kemija, a ne dokaz manje količine pohranjene masti.

Pokazatelj signalizacije opisuje regulaciju. SIRT1 je regulatorni enzim ovisan o NAD+ koji modificira proteine uključene u funkciju mitohondrija i metabolizam lipida. AMPK djeluje kao senzor niske razine energije koji, kada se aktivira, potiče oksidaciju goriva i ograničava sintezu lipida. Kada rad opisuje aktivaciju SIRT1 u jetri metilenskim modrilom, opisuje regulatornu promjenu. Time još ne opisuje ishod kod pacijenta.

Histološki ili biokemijski pokazatelj opisuje samu jetru. Uobičajeni su primjeri sadržaj triglicerida po gramu tkiva, bojenje neutralnih masti bojilom Oil Red O, procjena baloniranja i oštećenja bojenjem hematoksilinom i eozinom te aktivnost ALT-a u plazmi. Samo ta treća skupina pokazatelja odgovara na pitanje je li metilensko modrilo u tom eksperimentu ublažilo steatozu jetre.

Odvajanje tih skupina sprječava najčešće pogrešno tumačenje: povoljan redoks rezultat ili rezultat signalizacije ne znači manje masne jetre.

Etanolni model: redoks stanje ispravljeno, mast nepromijenjena

Najjasniji negativni nalaz dolazi iz istraživanja kroničnog unosa etanola u mužjaka štakora soja Wistar. Životinje su primale etanol kao dio tekuće prehrane, uz povećanje njegova udjela do 36 posto ukupne energije, dok su kontrolne životinje s usklađenim unosom hrane umjesto energije iz etanola dobivale glukozu. Jedna etanolna skupina i jedna kontrolna skupina također su primale metilensko modrilo u količini od 130 mg po litri prehrane, približno 42 mg po kg dnevno, od 5. do 30. dana.

Redoks stanje procijenjeno je iz standardnih parova metabolita: omjera laktata i piruvata za citosol te omjera 3-hidroksibutirata i acetoacetata za mitohondrije. U ranoj fazi unosa visokih doza etanola etanolne skupine pokazale su velike promjene: omjer NAD+ i NADH u citosolu bio je niži za približno 62 posto, a u mitohondrijima za približno 71 posto, uz višu razinu glicerol-3-fosfata. Metilensko modrilo u velikoj je mjeri preokrenulo te promjene i vratilo glicerol-3-fosfat blizu kontrolnih vrijednosti, bez promjene unosa etanola, prirasta tjelesne mase ili koncentracije etanola u serumu.

Mast u jetri pokazala je drukčiju sliku. Na 12. dan, prije znatnijeg nakupljanja masti, nije bilo razlike u trigliceridima između skupina. Na 27. dan etanolne skupine imale su velik porast triglicerida bez obzira na metilensko modrilo. Na 30. dan ukupni lipidi porasli su za približno 89 posto, a trigliceridi za približno 196 posto u životinja koje su dobivale etanol, ponovno bez utjecaja bojila. Centrilobularna masna infiltracija izgledala je jednako s tretmanom ili bez njega. Autori su zaključili da redoks promjena uzrokovana etanolom nije primarni uzrok masne jetre nakon dugotrajnog hranjenja u ovom modelu. Ovdje pomaže razumjeti kako se nalazi na životinjama i stanicama prenose na procjenu rizika za ljude: mehanizam može biti stvaran, a ipak ne određivati ishod.

To je istraživanje koje treba citirati kada netko tvrdi da svaka korekcija redoks stanja mora ukloniti mast iz jetre. U ovom eksperimentalnom postavu nije je uklonila.

Metabolički model: signalizacija uz manje masti, u miševa

Drukčija slika dolazi iz istraživanja na hepatocitima i miševima na prehrani bogatoj mastima, usmjerenog na SIRT1 i AMPK. U stanicama HepG2, stanicama AML-12 i primarnim hepatocitima štakora metilensko modrilo povisilo je omjer NAD+ i NADH, povećalo količinu proteina SIRT1, smanjilo acetilaciju regulatora PGC-1alpha, povećalo sadržaj mitohondrijske DNA i potrošnju kisika te aktiviralo AMPK uz posljedično povećanje CPT-1 i PPARalpha. Kada je ekspresija SIRT1 smanjena, aktivacija AMPK izostala je, što taj slijed povezuje sa SIRT1 u tom staničnom sustavu. Bojilo je također djelovalo protiv lipogenih signala izazvanih agonistom LXR-a T0901317 i izlaganjem palmitatu, uključujući indukciju SREBP-1c, FAS-a i ACC-a.

Životinjski dio istraživanja obuhvatio je mužjake miševa C57BL/6 koji su 8 tjedana dobivali prehranu sa 60 posto masti. Tijekom posljednja 4 tjedna metilensko modrilo davano je oralno četiri puta tjedno u količini od 3 ili 10 mg po kg dnevno. Tretirani miševi pokazali su manje bojenja bojilom Oil Red O, niži sadržaj triglicerida u jetri, manje baloniranja i masne degeneracije na histološkom pregledu te niži ALT u plazmi nego netretirani miševi na prehrani bogatoj mastima. Farmakokinetički dio istog rada utvrdio je oralnu bioraspoloživost od približno 31 do 35 posto, uz gotovo potpunu crijevnu apsorpciju, ali znatan metabolizam, te najviši omjer koncentracije u tkivu i plazmi u jetri. To čini učinak u jetri barem mogućim sa stajališta raspodjele.

To je stvaran pokazatelj učinka protiv steatoze, ali njegove su granice uske. Riječ je o kratkom eksperimentu na miševima s 9 do 10 životinja po skupini, jednom prehranom, dvjema dozama i četiri tjedna tretmana. Ispituje metaboličku steatozu i obilježja steatohepatitisa, a ne bolest povezanu s alkoholom, te ne ispituje cirozu, povlačenje fibroze ni bilo koji ishod kod ljudi. Uloga mitohondrijskih i redoks pokazatelja u tumačenju takvih rezultata jest označiti ih kao potporu hipotezi, a ne kao dozu ili protokol.

Presjek zdravog tkiva: ista doza, suprotni učinci u organima

Treće istraživanje često se uključuje u tvrdnje o jetri kojima ne pripada. U 30-dnevnom eksperimentu na zdravim ženkama štakora soja Wistar pet životinja primalo je 1 mM metilenskog modrila u vodi za piće, a pet je služilo kao kontrola. Superoksid-dismutaza, katalaza i reducirani glutation nisu se promijenili u jetri ni bubregu. Lipidna peroksidacija blago je porasla u jetri, a smanjila se u bubregu. ALT i kreatinin u serumu smanjili su se, bez promjene dušika ureje u krvi.

Pošteno tumačenje govori o tkivnoj specifičnosti u zdravih životinja, a ne o liječenju bolesti. Ista izloženost prema jednom je pokazatelju izgledala blago prooksidativno u jetri i blago zaštitno prema istom pokazatelju u bubregu, dok su standardni antioksidativni obrambeni mehanizmi ostali nepromijenjeni. Uz pet životinja po skupini i bez modela bolesti, ovaj rad upozorava da metilensko modrilo ne treba nazivati općim antioksidansom za jetru. Također pokazuje zašto promjene jetrenih enzima zahtijevaju jasno definiran kontekst bolesti prije nego što se mogu tumačiti kao poboljšanje.

Usporedba triju eksperimenata na jetri

Tablica jasno pokazuje glavnu poruku. Slično plavo bojilo, različita biologija. Istraživanje s etanolom odvaja uspjeh u redoks pokazateljima od neuspjeha u smanjenju masti. Istraživanje prehrane povezuje signalizaciju i smanjenje masti u jednom modelu. Istraživanje na zdravim životinjama pokazuje da se redoks pokazatelji mogu kretati u suprotnim smjerovima ovisno o organu.

Zašto iz toga ne proizlazi tvrdnja o liječenju

Nijedno od tih istraživanja nije uključivalo ljude s masnom jetrom. Doze, načini primjene i trajanja razlikuju se među radovima i ne mogu se jednostavnim preračunavanjem pretvoriti u režim za ljude. Male skupine, osobito tri životinje po vremenskoj točki mjerenja redoks stanja u radu s etanolom i pet po skupini u radu na zdravim životinjama, ostavljaju znatnu neizvjesnost. Spol, soj, sastav prehrane i vrijeme tretmana u odnosu na nastanak oštećenja razlikuju se. Dva modela bolesti predstavljaju i različite početne uzroke, pa pozitivan rezultat prehrambenog modela ne može poništiti negativan rezultat etanolnog modela ni obrnuto.

Za svakoga s dijagnosticiranom bolešću jetre važnije je ove nalaze čitati iz perspektive opreza nego liječenja. Pregled mjera opreza za bubrege i jetru pri uporabi metilenskog modrila objašnjava zašto oštećena funkcija organa mijenja sigurnosna pitanja čak i kada rad na životinjama izgleda povoljno. Liječniku donesite dijagnozu, nedavne laboratorijske nalaze, podatke o točnom proizvodu i načinu primjene te potpuni popis lijekova i pitajte koji dokazi podupiru taj proizvod za tu svrhu kod osobe s tim stupnjem oštećenja.

Zaključno: metilensko modrilo promijenilo je redoks stanje jetre u jednom etanolnom modelu bez smanjenja pohranjene masti, aktiviralo SIRT1 i AMPK uz smanjenje masti u jednom metaboličkom modelu na miševima te pokazalo redoks učinke specifične za pojedini organ u zdravih štakora. To je skup smjernica za istraživanje, a ne utvrđeno liječenje masne jetre.