Metilensko modrilo i izlaganje svjetlosti: valna duljina, iradijancija i geometrija tretmana

Dva rada navode izlaganje metilenskog modrila svjetlosti doze 10 J po kvadratnom cm. U jednom to ubija bakterije. U drugom nema mjerljivog učinka. Čitatelj koji uspoređuje samo dozu zaključuje da je područje istraživanja nedosljedno. Područje je dosljedno. Doza nikada nije predstavljala cjelokupno izlaganje.

Izlaganje svjetlosti mali je sustav parametara koji djeluju zajedno: valna duljina, iradijancija, trajanje, rezultirajuća fluencija, dostupnost kisika, koncentracija bojila i stanje agregacije, vremenski razmak između primjene bojila i svjetlosti te optički put kojim svjetlost stvarno prolazi kroz uzorak. Promijenite jedan od njih i fotokemija se mijenja. Ovaj članak obrađuje svaki parametar, a zatim razlikuje fotobiomodulaciju bliskim infracrvenim svjetlom od izravne fotoaktivacije bojila, jer se ta dva režima najčešće miješaju.

Valna duljina određuje sudjeluje li bojilo

Metilensko modrilo u vodi snažno apsorbira crvenu svjetlost u monomernom obliku, s maksimumom blizu 664 do 665 nm i ramenom apsorpcijske vrpce na kraćoj valnoj duljini, blizu 610 nm, koje raste kako se bojilo agregira u dimere i veće nakupine. Molarni ekstinkcijski koeficijent blizu maksimuma reda je veličine 65,000 do 85,000 M-1 cm-1, pa su već mikromolarne otopine intenzivno plave. Rani pregled fotokemije metilenskog modrila s DNA i biološkim supstratima opisuje to apsorpcijsko ponašanje i kemiju pobuđenih stanja koja slijedi: apsorpcijom nastaje kratkoživuće singletno stanje, koje prelazi u dulježivuće tripletno stanje uz zabilježene prinose blizu 0.5, a u aeriranoj otopini kisik ga gasi unutar približno 2 mikrosekunde.

U tom se koraku gašenja razdvajaju dva fotokemijska puta. U kemiji tipa II tripletno bojilo prenosi energiju na kisik u osnovnom stanju i stvara singletni kisik, uz često navođene prinose blizu 0.52. U kemiji tipa I triplet umjesto toga prenosi elektron ili vodik na supstrat, stvarajući radikale, uključujući superoksidne i hidroksilne vrste. Oba puta mogu se odvijati istodobno, a uobičajeni fotodinamički učinak ostaje snažno ovisan o kisiku čak i kada doprinosi put tipa I.

Iz toga proizlazi jednostavno pravilo za odabir valne duljine za metilensko modrilo. Crvena svjetlost od približno 630 do 680 nm preklapa se s apsorpcijskom vrpcom bojila, pri čemu je raspon od 660 do 665 nm blizu maksimuma monomera, pa može pokrenuti kemijske reakcije fotosenzibilizatora svugdje gdje je prisutna znatna količina bojila. Blisko infracrveno svjetlo pri 810 nm nalazi se daleko izvan apsorpcijske vrpce osnovnog stanja, pa je to slabo prikladna valna duljina za izravno pobuđivanje bojila. Koncentracija doista komplicira sliku na jedan način: kako raste, veći dio bojila nalazi se u dimernim i agregiranim oblicima koji apsorbiraju prema 610 nm i manje učinkovito fotosenzibiliziraju po molekuli, pa udvostručenje količine bojila ne udvostručuje učinak. Popratni pregled metilenskog modrila i terapije crvenim svjetlom razmatra ovo pravilo apsorpcije kao preduvjet za svaku fotosenzibiliziranu reakciju.

Iradijancija, trajanje i fluencija tri su parametra, a ne jedan

Fluencija, izražena u J po kvadratnom cm, umnožak je iradijancije i vremena. Navođenje samo fluencije skriva brzinu kojom je energija pristizala, a ta je brzina važna.

Visoka iradijancija tijekom kratkog vremena i niska iradijancija tijekom dugog vremena mogu dati istu fluenciju uz različitu kemiju. Visoka iradijancija troši otopljeni kisik brže nego što ga difuzija nadoknađuje, što tijekom izlaganja ograničava put tipa II ovisan o kisiku. Također dovodi toplinu, a tkivo na zagrijavanje reagira promjenama protoka krvi koje mijenjaju i oksigenaciju i raspodjelu bojila. Niska iradijancija tijekom dugog izlaganja održava opskrbu kisikom, ali procesima popravka i ponovne oksigenacije daje vrijeme da djeluju tijekom samog izlaganja. Udžbenici fotokemije pretpostavku da je važna samo ukupna doza nazivaju zakonom reciprociteta. On ne vrijedi kad god sudjeluju kisik, zagrijavanje ili biološki procesi, što je u tkivu gotovo uvijek slučaj.

Antimikrobna fotodinamička izlaganja s metilenskim modrilom kod ljudi često koriste 6 do 18 J po kvadratnom cm, što se preklapa s vrijednostima za fotobiomodulaciju. Sama fluencija stoga ne može odrediti režim. Izlaganje od 10 J po kvadratnom cm pri 660 nm u tkivu koje sadrži bojilo predstavlja fotokemiju pokrenutu fotosenzibilizatorom. Ista fluencija pri 810 nm u tkivu s tragovima bojila nešto je posve drugo. Broj je isti. Koncept je drukčiji.

Optički put i geometrija uzorka određuju što svjetlost susreće

Beer-Lambertov zakon znači da prednji dio uzorka prima mnogo više svjetlosti od stražnjega. U kiveti s bojilom u koncentraciji od nekoliko desetaka mikromola prvi milimetar može apsorbirati većinu upadne crvene svjetlosti, ostavljajući dublje slojeve praktički neizloženima. Smjestite li istu otopinu u plitku jažicu malog volumena, izlaganje postaje gotovo jednoliko. Isto bojilo, ista svjetiljka, ista fluencija na površini, drukčiji rezultat.

Tkivo uz apsorpciju uvodi i raspršenje. Crvena svjetlost blizu 660 nm prodire do dubine reda veličine milimetara, a točnu dubinu određuju sadržaj krvi, pigmentacija i vrsta tkiva. Jažice uvode vlastite artefakte: djelovanje meniskusa kao leće, refleksiju od stijenki, zasjenjenje rubnih jažica i zagrijavanje malih volumena ispod izvora. Dva laboratorija koja navode jednake postavke svjetiljke, ali različite vrste ploča, volumene ili udaljenosti izvora, provela su različite pokuse.

Udaljenost zaslužuje poseban naglasak jer je najčešća prešućena varijabla. Iradijancija brzo opada s udaljenošću od nekolimiranog izvora, pa pomicanje svjetiljke s 2 cm na 5 cm iznad ploče može višestruko smanjiti iradijanciju, dok odjeljak o metodama i dalje glasi isto. Bez izmjerene iradijancije na površini uzorka objavljene fluencije izračunate iz nazivnih vrijednosti snage proizvođača procjene su, a ne mjerenja.

Vodič kroz parametre s napomenama: što izlaganje čini ponovljivim

Izvorni prilog za ovu stranicu kontrolni je popis. Nijedno izlaganje svjetlosti u studiji koje izostavlja ove stavke ne može se usporediti s drugim, koliko god slična izgledala istaknuta doza.

1. Valna duljina i širina spektralne vrpce. Maksimum i puna širina, a ne naziv boje. Crveni LED pokriva 630 do 680 nm, raspon u kojem se apsorpcija bojila znatno razlikuje.
2. Iradijancija na površini uzorka, izmjerena, u mW po kvadratnom cm. Snaga koju navodi proizvođač nije iradijancija.
3. Trajanje i pulsiranje. Kontinuirano nasuprot pulsnom izlaganju, uključujući frekvenciju impulsa i radni ciklus gdje je primjenjivo.
4. Fluencija izračunata iz prethodno navedenog para izmjerenih veličina, u J po kvadratnom cm.
5. Koncentracija bojila, formulacija i stanje agregacije. Monomer blizu 664 nm fotosenzibilizira drukčije od agregata blizu 610 nm.
6. Vremenski razmak između primjene sredstva i svjetlosti. Minute do sati između primjene bojila i ozračivanja, što određuje gdje se bojilo nalazi kada svjetlost stigne.
7. Oksigenacija. Aerirana otopina nasuprot hipoksičnom tkivu izravno mijenja ravnotežu između tipa I i tipa II.
8. Geometrija. Dubina uzorka, volumen, vrsta posude, udaljenost i kut izvora te dubina ciljanog područja u tkivu.

Korisna navika pri čitanju radova: prvo provjerite vremenski razmak između primjene sredstva i svjetlosti. On otkriva namjeru. Fotodinamički protokoli namjerno ozračuju tkivo koje sadrži bojilo. Kombinirani protokoli mogu namjerno vremenski razdvojiti te dvije intervencije, kao u nastavku.

Fotobiomodulacija bliskim infracrvenim svjetlom nije fotoaktivacija bojila

Fotobiomodulacija, obično skraćeno PBM, koristi crveno ili blisko infracrveno svjetlo za modulaciju endogene signalizacije bez dodavanja fotosenzibilizatora. Fotodinamička terapija, obično skraćeno PDT, istodobno koristi tri sastavnice: svjetlost koju senzibilizator apsorbira, sam senzibilizator i kisik, kako bi stvorila nagli porast reaktivnih vrsta koje oštećuju cilj. Pregled mitohondrija kao cilja neuroprotekcije povezuje metilensko modrilo s PBM-om jer djeluju na respiraciju iz različitih smjerova: bojilo djeluje kao katalitički redoks-posrednik koji podržava protok elektrona, dok se pretpostavlja da PBM potiče odvajanje inhibitornog dušikova monoksida od citokrom c oksidaze u kompleksu IV. Taj enzimski mehanizam treba i dalje jasno označavati kao hipotezu.

Dvije najčešće citirane studije kombiniranih intervencija na miševima koriste svjetlost od 810 nm, što je upravo razlog zašto ne dokazuju fotoaktivaciju bojila. U studiji prethodnog tretmana prije deprivacije sna miševi su prije deprivacije svakodnevno dobivali metilensko modrilo u dozi od 0.5 mg po kg, pulsni laser od 810 nm svaki drugi dan ili oboje. Kombinirani prethodni tretman zaštitio je ponašanja povezana s pamćenjem i sinaptičke proteine hipokampusa, dok pojedinačni tretmani uglavnom nisu bili uspješni. U studiji kroničnog stresa s istodobnim tretmanom miševi su primali PBM od 810 nm pri 8 J po kvadratnom cm uz svakodnevno bojilo u dozi od 0.5 mg po kg, pri čemu je laser primijenjen prvi, a bojilo ubrizgano dva sata kasnije upravo kako bi se izbjeglo ozračivanje tkiva koje sadrži bojilo. U svim trima skupinama uklonjeni su deficiti učenja, uz aditivnu korist uglavnom za serumski kortizol i reaktivne kisikove vrste u mozgu. Ovi rezultati ispituju dvije mitohondrijske intervencije primijenjene zajedno, a zbirka fotodinamičkih studija tu razliku jasno prikazuje bilježenjem valne duljine za svaku indikaciju.

Dokazi za kožu nalaze se na drugoj strani. Podaci o metilenskom modrilu i svjetlosti na ljudskoj koži uglavnom se odnose na raspon od 630 do 680 nm, uz topikalnu ili intralezijsku primjenu bojila i namjeru uništavanja ili remodeliranja, što je po definiciji PDT. Navoditi tako postignuto uklanjanje promjena kao dokaz da bojilo pojačava PBM ili navoditi oporavak kod miševa pri 810 nm kao dokaz da panel od 660 nm uz bojilo predstavlja protokol za kognitivne funkcije znači miješati režime. Referentni pregled doziranja i farmakologije te vodič za sigurnost i interakcije dodatno obrađuju dijelove ove teme koji se odnose na koncentraciju i kontraindikacije.

Imenujte koncept prije nego što usporedite brojke. Valna duljina određuje apsorbira li bojilo svjetlost. Iradijancija i trajanje određuju što se kemijski događa nakon te apsorpcije. Geometrija određuje koji dio uzorka uopće doživljava te procese. Dva izlaganja koja se podudaraju u jednom parametru, a razlikuju u ostalima, različiti su pokusi; smatrati ih međusobno zamjenjivima pogreška je koju ovaj vodič nastoji spriječiti. Iz svega navedenog ne proizlazi nikakav protokol za kućnu primjenu; svjetlost odgovarajuće valne duljine uz sistemski primijenjeno bojilo pretvara inače modulacijsko izlaganje u fotokemiju pokrenutu fotosenzibilizatorom, koja pripada u ruke kliničkih stručnjaka.