Metilensko modrilo i autofagija: AMPK, mTOR i pokusi na neuronskim stanicama

Zamislite da provodite pokus na stanicama, dodate metilensko modrilo i primijetite da proteinska vrpca nazvana LC3-II na vašem imunoblotu postaje tamnija. Primamljivo je objaviti da spoj „potiče autofagiju” i nastaviti dalje. Takvo je tumačenje preuranjeno. Tamnija vrpca LC3-II može značiti da stanica stvara više vezikula za uklanjanje otpada, ali može značiti i da se vezikule nakupljaju jer je korak razgradnje blokiran. Ta dva tumačenja upućuju na suprotne zaključke, a literatura o metilenskom modrilu u neuronskim stanicama sadrži primjere dokaza obiju vrsta. Ovaj članak prolazi kroz ono što se doista mjerilo, analizu po analizu.

Makroautofagija, oblik koji se ovdje proučava, proces je kojim stanica skupno reciklira svoj sadržaj. Membranska vrećica nazvana fagofor raste oko istrošenih proteina i organela, zatvara se u autofagosom, stapa se s lizosomom, a njezin se sadržaj razgrađuje i oslobađa za ponovnu uporabu. Neuroni ovise o tom procesu jer se ne dijele i ne mogu diobom razrijediti oštećene dijelove. Kada recikliranje zastane, otpad se nakuplja. Kada funkcionira, stanica u uvjetima stresa ponovno dobiva gradivne sastavnice.

Što je pokazao jedan pokus na hipokampalnim stanicama

Glavno istraživanje indukcije koristilo je mišje hipokampalne stanice HT22 izložene stresu uskraćivanjem seruma tijekom 24 sata. U takvim se uvjetima uklanjaju čimbenici rasta i trofički signali te se pokreću i apoptoza i autofagija. Istraživači su izvijestili da je metilensko modrilo smanjilo odumiranje stanica ovisno o dozi te da su tu zaštitu pratili znakovi makroautofagije.

Slijed promjena biljega bio je specifičan. Difuzno obojenje LC3B-a preraspodijelilo se u perinuklearne točkaste nakupine počevši od približno 20 nM metilenskog modrila, uz najizraženiji odgovor LC3-I i LC3-II pri približno 1 μM. I LC3B-I i LC3B-II povećavali su se ovisno o dozi i vremenu. Ključno je to što je tim otišao korak dalje od statičnog imunoblota LC3. Dodali su 10 μM klorokina, koji blokira lizosomsko uklanjanje, te u stanicama tretiranima metilenskim modrilom utvrdili višu razinu LC3-II i stabiliziran p62. Takav obrazac podupire razgradnju i obnovu ovisnu o lizosomima, a ne puko nakupljanje. Pokazali su i da je klorokin djelomično poništio antiapoptotski učinak, što u ovom modelu povezuje zaštitu s putem autofagije i lizosoma.

Rezultat vezan uz signalizaciju dio je koji se najčešće pogrešno prenosi. Signalizacija AMPK, procijenjena prema fosforiliranom AMPK-u i njegovoj nizvodnoj meti, fosforiliranom ACC-u, povećala se nakon 12 i 24 sata ovisno o dozi. Inhibitor AMPK-a Compound C, primijenjen pri 20 μM tijekom posljednja 4 sata, smanjio je i fosforilaciju ACC-a i aktivaciju LC3. Nasuprot tome, fosforilirani mTOR nije pokazao mjerljivu supresiju. Dakle, u hipokampalnim stanicama pod stresom utvrđena je indukcija povezana s AMPK-om putem naizgled neovisnim o mTOR-u. Isti se obrazac pojavio u živih miševa, u kojih je tretman metilenskim modrilom inducirao biljege makroautofagije u moždanoj kori i hipokampusu.

Indukcija nije dovršeni autofagijski protok

Ovdje je razlika između pojmova najvažnija. Indukcija znači da uzvodni mehanizmi stvaraju više autofagosoma. Protok znači da sadržaj prolazi cijeli put: izdvajanje, sazrijevanje, stapanje s lizosomom, razgradnju i recikliranje. Svako povećanje LC3-II ostaje tvrdnja o indukciji dok test protoka ne potvrdi ostatak tog puta.

Standardni test protoka mjeri LC3-II uz kratkotrajnu lizosomsku blokadu, primjerice bafilomicinom A1 ili klorokinom, i bez nje. Ako tretman doista ubrzava stvaranje, blokiranje razgradnje trebalo bi dodatno povisiti LC3-II. Tandemski reporter mCherry-GFP-LC3 pruža drugi uvid: strukture svijetle žuto prije stapanja s lizosomom, a nakon što kisela sredina ugasi signal GFP-a, svijetle samo crveno. Stoga veći broj isključivo crvenih točkastih nakupina podupire napredovanje prema kiselim autolizosomima. Pad razine proteina p62 može dodatno potvrditi razgradnju i obnovu sadržaja, uz napomenu da i sama transkripcija p62 odgovara na stres te je treba provjeriti na razini mRNA.

Kontrolni popis u nastavku povezuje svaku analizu korištenu u ovoj literaturi s onim što mjeri i onim što sama ne može dokazati. Čitatelji ga mogu ponovno upotrijebiti za bilo koju buduću tvrdnju o makroautofagiji, uključujući argumente o postu i dugovječnosti koji se oslanjaju na ove biljege.

Obratite pozornost na jednu terminološku zamku od koje tablica štiti. Fosforilirani ACC enzimski je inhibiran oblik. Njegov porast pokazuje učinak AMPK-a, a ne aktivaciju ACC-a.

Izraz „inhibicija makroautofagije poništila je neuroprotekciju” zahtijeva jednaku preciznost. U modelu HT22 to znači da je ometanje puta autofagije i lizosoma uklonilo prednost u preživljavanju koju je metilensko modrilo pružalo pri uskraćivanju seruma. To podupire autofagiju kao nužan čimbenik ili čimbenik koji pridonosi učinku u toj kulturi. Ne utvrđuje da je autofagija jedini zaštitni mehanizam tog spoja niti dokazuje da klorokin djeluje isključivo putem autofagije, a za učvršćivanje tvrdnje o uzročnosti bile bi potrebne genetske intervencije u ATG5, ATG7 ili ULK1.

Dva puta prema istom mehanizmu

Pojednostavljeni prikaz može pomoći. Energetski stres povećava aktivnost AMPK-a, AMPK aktivira kompleks ULK1 i autofagija započinje. Čimbenici rasta i hranjive tvari povećavaju aktivnost mTORC1, mTORC1 inhibira ULK1 i autofagija ostaje isključena. Nizvodno od ULK1, kompleks Beclin-1 i VPS34 pokreće nastanak fagofora, LC3-I lipidacijom prelazi u LC3-II, autofagosom se zatvara i stapa s lizosomom, a sadržaj se razgrađuje uz razgradnju i obnovu p62.

Dijagram smješta svaki nalaz za metilensko modrilo na taj prikaz: hipokampalni rezultat uz granu AMPK, a rezultat na progenitorskim stanicama uz granu mTOR.

Takav okvir razjašnjava prividno neslaganje s drugim istraživanjem Xieja i suradnika. U proliferirajućim neuralnim progenitorskim stanicama štakora zaseban pokus pokazao je da 5 μM metilenskog modrila inhibira proliferaciju i potiče mirovanje. Broj stanica pozitivnih na Ki67 smanjio se 1. i 3. dana, dok je diferencijacija stanica već usmjerenih prema neuronskoj lozi ostala očuvana. Ondje je mehanizam djelovao putem potisnute signalizacije mTOR: smanjene razine ukupnog i fosforiliranog mTOR-a, uz nižu ekspresiju p70S6K i 4EBP1 te smanjenu ekspresiju ciklina E1, B1, D1 i D2. Dominantan fenotip bilo je mirovanje progenitorskih stanica, koje su autori povezali s odgođenom senescencijom, a ne spašavanjem hipokampalnih stanica pod stresom.

Između tih dvaju radova nema proturječja. AMPK i mTOR integriraju signale ovisno o kontekstu; nisu nepromjenjivi prekidači. Stanica nalik neuronu pod stresom može aktivirati AMPK bez mjerljive inhibicije mTOR-a, dok progenitorska stanica potaknuta mitogenima može na isti spoj odgovoriti usporavanjem mehanizama rasta ovisnih o mTOR-u. Vrsta stanice, kontekst stresa, koncentracija i vremenska točka određuju koja grana prevladava. Zato u istu sliku pripadaju i učinci metilenskog modrila na mitohondrijsku energetiku i redoks-procese: kako opisuje pregled mehanizama neuroprotekcije, spoj djeluje kao alternativni prijenosnik elektrona, uključuje antioksidacijsku i antiapoptotsku signalizaciju, inhibira MAO i NOS te je povezan s obnovom mitohondrija putem biogeneze i autofagije. Autofagija je jedna grana pleiotropnog profila, a ne cijela priča.

Što pokusi ne pokazuju

Uskraćivanje seruma modelira trofički i metabolički stres u kulturi stanica. Ne modelira post na razini cijelog organizma: glukoza, aminokiseline i soli ostaju u osnovnom mediju, a ponašanje povezano s hranjenjem ne postoji. Koncentracije u kulturi od 20 nM do 5 μM ne mogu se aritmetički pretvoriti u doze za ljude jer se apsorpcija, vezanje za proteine, redoks-stanje, metabolizam, nakupljanje u tkivima i vrijeme izloženosti razlikuju.

Nijedno ispitivanje na ljudima nije osmišljeno kako bi dokazalo autofagijski protok induciran metilenskim modrilom u pacijenata. Dokazi o mehanizmima i dalje potječu iz rada na stanicama, ex vivo i na životinjama, a pregledni radovi dokaze za prijenos tih nalaza u kliničku primjenu još opisuju kao preliminarne. Stoga ova istraživanja ne pokazuju da metilensko modrilo oponaša post, produljuje ljudski život putem autofagije ili omogućuje dovršeni autofagijski protok u ljudskom mozgu. Tvrdnje o oponašanju posta i dugovječnosti zahtijevaju vlastite kliničke dokaze, a ispitivanja metilenskog modrila na ljudima za druge indikacije ne postaju ispitivanja autofagije samim povezivanjem s njom. Istraživanja modela stresa zbog dostupnosti hranjivih tvari i dugovječnosti treba čitati uz jasno uvažavanje te granice.

Pri čitanju sljedećeg rada primijenite kontrolni popis redom. Najprije se zapitajte koja se grana promijenila: AMPK, mTOR ili nijedna. Zatim provjerite je li rezultat za LC3 bio popraćen testom protoka ili stoji samostalno. Potom provjerite je li blokiranje puta uklonilo korist i kojom metodom. Istraživanje koje odgovara na sva tri pitanja opravdava snažnu tvrdnju o mehanizmu. Ono koje odgovara samo na prvo pokazalo je signal koji dopušta proces, dok ostatak puta ostaje neistražen.