Metilensko modrilo i potporne stanice mozga: astrociti, mikroglija i upala

Zamislite da provedete dva eksperimenta s istim plavim bojilom i dobijete dva ohrabrujuća rezultata. U jednoj posudi zvjezdaste potporne stanice prežive gubitak kisika i glukoze. U drugoj imunosne stanice mozga zadržavaju svoj mirujući razgranati oblik unatoč bakterijskom toksinu. Primamljivo je spojiti ta dva rezultata u jednu tvrdnju: bojilo smiruje upalu u mozgu i štiti mozak. Upravo je to spajanje trenutak u kojem pažljivi čitatelji trebaju zastati.

Mozak ima dvije populacije potpornih stanica s različitim zadaćama, a metilensko modrilo ispituje se na svakoj od njih uz drukčiji eksperimentalni podražaj. Astrociti su stanice koje pružaju metaboličku potporu. Smješteni su između krvnih žila i neurona, uklanjaju višak glutamata, održavaju ravnotežu kalija, pohranjuju glikogen i prenose gorivo neuronima kada potrebe naglo porastu. Mikroglija je stalni imunosni nadzornik. Njezini tanki izdanci nadziru tkivo, otkrivaju bakterijske signale i signale oštećenja te se pri uzbuni povlače, poprimajući zaobljeni ameboidni oblik prilagođen migraciji i gutanju čestica, uz otpuštanje signalnih molekula. Rezultat iz jedne populacije ne može se prenijeti na drugu, a mjerenje primijenjeno u svakom slučaju određuje što je zapravo pokazano.

Astrociti pod metaboličkim stresom: presudno je vrijeme primjene

Eksperiment s astrocitima počinje uskraćivanjem. Istraživači su uzgojili kortikalne astrocite novorođenih miševa, uklonili glukozu i gotovo sav kisik na šest sati, a zatim ih oboje vratili na dvadeset četiri sata, što je laboratorijski model moždanog udara praćenog reperfuzijom. Kada je metilensko modrilo bilo prisutno tijekom faze uskraćivanja, preživljavanje stanica bilo je slabije. Kada je dodano samo tijekom faze reoksigenacije, u koncentracijama od 0.1 i 1 mikromolara, preživljavanje se značajno poboljšalo prema testu vijabilnosti s kalceinom. Studija na mišjim astrocitima opisuje tu razliku povezanu s vremenom primjene uz podatke o respiraciji.

Ta je razlika najvažniji nalaz. Tijekom uskraćivanja gotovo nema kisika koji bi prihvatio elektrone, pa prijenosnik elektrona nema kamo predati elektrone. Tijekom reoksigenacije stanični se mehanizmi ponovno pokreću i bojilo dobiva svoju ulogu. Tretirani astrociti trošili su više kisika, unosili više glukoze, proizvodili više ATP-a i obnavljali zalihe glikogena, uz veću aktivnost heksokinaze i bez porasta mitohondrijskog superoksida. Predloženo objašnjenje poznato je iz prikaza metilenskog modrila kao mitohondrijskog prijenosnika elektrona: ono prenosi elektrone mimo blokiranih mjesta u respiracijskom lancu, tako da se respiracija ponovno pokreće bez skretanja elektrona u nastanak reaktivnih vrsta.

Obratite pozornost na to o kakvim je dokazima riječ. To je rezultat koji se odnosi na preživljavanje i metabolizam jedne izolirane vrste stanica, s utvrđenim vremenskim okvirom djelovanja (oporavak, a ne uskraćivanje) i utvrđenim rasponom koncentracija. Ne govori ništa o imunosnoj signalizaciji ni o ponašanju.

Mikroglija pod bakterijskom uzbunom: reprogramirani metabolizam

Eksperimenti s mikroglijom počinju suprotnim podražajem: ne gladovanjem, nego lažnom infekcijom. Lipopolisaharid, fragment vanjske membrane bakterija, veže se za senzore urođene imunosti i uvjerava mikrogliju da su stigli patogeni, iako nema živih bakterija. U miševa kojima je primijenjen lipopolisaharid i u uzgojenoj mikroglijalnoj staničnoj liniji rezultat je poznat upalni program: raste razina proupalnih čimbenika, mikroglija se polarizira prema agresivnom stanju M1, susjedni neuroni odumiru, a životinje postižu slabije rezultate u zadacima učenja i pamćenja.

Studija tog odgovora na miševima povezuje ga sa signalnim putom koji prepoznaje razinu kisika: lipopolisaharid potiče prekomjernu ekspresiju PHD3, jednog od triju enzima prolil-hidroksilaze, putem uzvodnog lanca Siah2/Morg1. Istodobno stanice reprogramiraju svoju potrošnju energije prema aerobnoj glikolizi, uz povišene razine mitohondrijskih reaktivnih kisikovih vrsta. Autori su taj pomak izravno izmjerili metaboličkim testovima Seahorse koji prate potrošnju kisika i izvanstanično zakiseljavanje. Metilensko modrilo poništilo je i metabolički pomak i prekomjernu ekspresiju PHD3, snizilo razine upalnih čimbenika, smanjilo odumiranje neurona i poboljšalo rezultate testova ponašanja. Pozitronska emisijska tomografija dodala je slikovne podatke: lipopolisaharid je povećao unos glukoze u hipokampusu na FDG-PET-u, a tretman ga je ponovno smanjio, što je u skladu sa smirenijim upalnim metabolizmom u živom mozgu.

To je bogatiji skup mjerenja nego u studiji s astrocitima (citokini, metabolizam, slikovne pretrage, ponašanje životinja), ali odnosi se na drukčiji podražaj i drukčiju stanicu. Čitatelji koji uspoređuju te dvije studije trebaju razlikovati podražaje: jedna studija spašava izgladnjele potporne stanice tijekom oporavka, a druga prigušuje lažnu uzbunu zbog infekcije u imunosnim stanicama.

Mikroglija pod mikroskopom: oblik kao pokazatelj

Treći eksperiment promatra istu bakterijsku uzbunu samo kroz oblik stanica. U glijalnim kulturama iz korteksa štakora kontrolne mikroglijalne stanice obojene na biljeg IBA1 pokazuju brojne tanke izdanke, odnosno razgranati oblik za nadzor tkiva. Nakon dvadeset četiri sata izlaganja lipopolisaharidu u koncentraciji od 10 mikrograma po mililitru stanice se spljošte u ameboidni oblik, a površina njihova staničnog tijela raste dok opseg ostaje približno jednak, što je geometrijski pokazatelj zaobljivanja. Metilensko modrilo u koncentraciji od 1 mikromolara, primijenjeno zajedno s toksinom, očuvalo je razgranate izdanke i zadržalo površinu i opseg staničnog tijela blizu kontrolnih vrijednosti. Studija na kulturama štakorskih stanica kvantificira to očuvanje oblika mjerenjima površine i opsega staničnog tijela.

Dva detalja čine ovu studiju vrjednijom od obične slike. Prvo, usporedni spoj menadion, druga redoks-aktivna molekula u istoj koncentraciji, nije očuvao oblik, a sam je usmjeravao stanice prema aktiviranom obliku. Dakle, taj učinak nije opće svojstvo svih molekula koje sudjeluju u redoks-ciklusima. Drugo, autori povezuju učinak bojila s aktivacijom Nrf2, transkripcijskog čimbenika koji upravlja programom antioksidacijskih i protuupalnih gena, a ne samo s izravnim uklanjanjem reaktivnih vrsta. Povezani prikazi redoks i upalne signalizacije stavljaju tu vezu s Nrf2 u kontekst.

Ipak, oblik pruža najslabiji dokaz od ta tri pokazatelja. Razgranata stanica obično nadzire tkivo, a zaobljena je obično aktivirana, ali morfologija je posredan pokazatelj, a ne transkript. U toj kulturi nije bilo imunosnih stanica iz krvi, neuronskih krugova ni podataka o ponašanju.

Usporedno čitanje triju rezultata

Zajednički obrazac u svim redcima jest da svaki podražaj ima svoje mjerenje i svoj odgovor. Metaboličko spašavanje odgovara na pitanje o metabolizmu. Podaci o citokinima i ponašanju odgovaraju na pitanje o upali. Oblik odgovara na pitanje o obliku. Nijedan od ta tri rezultata sam po sebi ne može odgovoriti na pitanja iz drugih područja.

Što mikroglija mirnijeg izgleda ne dokazuje

Cijela ova tema zahtijeva sljedeću rečenicu: mikroglija koja izgleda manje aktivirano ili promijenjen metabolizam mikroglije sami po sebi ne dokazuju poboljšanu funkciju mozga.

Morfologija se može promijeniti bez odgovarajuće promjene funkcije. Stanica može zadržati svoje izdanke i pritom i dalje otpuštati citokine ili se zaobliti dok korisno uklanja stanične ostatke. Metabolička mjerenja imaju isto ograničenje: zapis sustava Seahorse ili PET snimka pokazuju upravljanje energijom, a ne kogniciju. Studija na miševima koja je povezala metaboličke pokazatelje i pokazatelje nalik morfološkima s testovima ponašanja snažnija je upravo zato što je povezala više razina dokaza umjesto da je zaključak temeljila na jednom mjerenju. Čak i ondje vrijede uobičajena ograničenja: lipopolisaharid modelira sterilnu uzbunu, a ne stvarnu infekciju, miševi nisu ljudi, a i sami autori upozoravaju na razlike među vrstama. Svatko tko planira daljnja istraživanja treba razmotriti koliko se nalazi o mikrogliji mogu prenijeti između modela prije nego što pretpostavi da se taj signalni put jednako ponaša u ljudskom tkivu.

Iz toga slijedi praktična posljedica za vrijeme primjene. U eksperimentu s astrocitima rana primjena imala je nepovoljan učinak, a primjena tijekom oporavka povoljan. Rezultati za mikrogliju potječu iz primjene vremenski bliske upalnom podražaju. Ozljeda mozga u stvarnom životu istodobno uključuje obje faze: energetski slom i imunosnu uzbunu koji se razvijaju tijekom više sati. Eksperiment koji izolira jednu fazu ne može odrediti raspored primjene za njihovu kombinaciju, zbog čega se u raspravama o vremenskim okvirima primjene odvojeno razmatraju tijek uskraćivanja i tijek upale.

Pošten sažetak stane u jedan odlomak. U izoliranim astrocitima metilensko modrilo primijenjeno tijekom reoksigenacije ponovno pokreće respiraciju i spašava stanice. U mikrogliji izloženoj bakterijskom fragmentu poništava upalni metabolički program putem specifičnog signalnog puta PHD3 i čuva mirujući oblik. Svaki je rezultat stvaran unutar svojih eksperimentalnih uvjeta, a nijedan nije opći zaključak o upali mozga. Usporedba glijalnih stanica korisna je upravo zato što sprječava stapanje tih dviju priča u jednu.