Metilensko modrilo kao indikator anaerobnih uvjeta i kisika: što promjena boje dokazuje

Tehničarka zatvara anaerobnu posudu, kroz poklopac provjerava indikatorsku trakicu s metilenskim modrilom i vidi ono što želi vidjeti. Trakica je iz plave postala bijela. Bilježi da je postupak proveden u anaerobnim uvjetima i nastavlja s radom. Dva dana poslije na jednoj ploči nema rasta, dok zatvorena epruveta s bujonom u istoj posudi pokazuje znakove izloženosti kisiku. Trakica je govorila istinu. Tehničarka joj je postavila pogrešno pitanje.

Zabuna proizlazi iz miješanja pojmova. Anaerobni indikator s metilenskim modrilom temelji se na redoks-uvjetima, a ne na sterilnosti ili validaciji cijelog sustava. Kad je ta razlika jasna, trakica postaje precizan i pouzdan instrument s usko određenom zadaćom.

Načelo: reverzibilni redoks-par

Otopljeno metilensko modrilo postoji u dva oblika. Oksidirani oblik je poznati plavi kation. Reducirani oblik, nazvan leucometilensko modrilo, bezbojan je. Pri približno neutralnom pH pojednostavljena polureakcija uključuje jedan plavi kation, jedan proton i dva elektrona, iz kojih nastaje jedna bezbojna leukomolekula. Formalni potencijal iznosi približno plus 11 milivolta u odnosu na standardnu vodikovu elektrodu pri pH 7, što ga smješta u raspon koji mnogi reducirajući sustavi mogu dosegnuti i u kojem kisik može preokrenuti reakciju.

Za redukciju je potreban nizak lokalni redoks-potencijal. Samo uklanjanje kisika ne osigurava ga uvijek. Rana istraživanja anaerobnih uvjeta pokazala su da metilensko modrilo u običnoj vodi bez kisika zadržava boju ako nije prisutna reducirajuća tvar te da smjese bujona s dekstrozom i približno 0.01 posto bojila lako gube boju pri 37 C, dok ista smjesa pri 4 C ostaje plava tijekom jednog dana, kako je opisano u pokusima sa svježim tkivom i anaerobnim uvjetima uzgoja. Temperatura, pH, glukoza, askorbat, tioglikolat i redukcijska aktivnost mikroorganizama određuju jesu li elektroni dostupni.

Za ponovnu oksidaciju potreban je samo kisik. Kad zrak dopre do leukooblika, on ponovno postaje plav. Suvremeni konstruirani indikatori iskorištavaju upravo taj ciklus: bojilo, redukcijsko sredstvo i stabilizirajuću matricu, koji pri niskoj razini kisika postaju bezbojni, a pri izlaganju zraku ponovno plavi, kao što je pokazano u hibridnom indikatoru kisika s metilenskim modrilom na temelju bojila, redukcijskog sredstva, površinski aktivne tvari i gline. Taj je prototip sadržavao bojilo u koncentraciji 0.01 milimola po litri te askorbat ili glukozu u koncentraciji 2.0 milimola po litri pri pH 11, postajao je bezbojan pri približno 0.5 volumnih posto kisika i u ispitnoj komori razlikovao razine ispod 0.1 posto od onih iznad 0.5 posto kisika.

Načelo rada stoga je jednostavno. Plava boja znači da je područje indikatora oksidirano. Bezbojnost znači da su u području indikatora postignuti reducirajući uvjeti s niskom razinom kisika. Promjena je reverzibilna, lokalna i kemijska. Sama po sebi ne govori ništa o mikroorganizmima.

Kako djeluje indikatorska trakica s metilenskim modrilom u anaerobnoj posudi

Indikatorska trakica s metilenskim modrilom za anaerobnu posudu malo je reakcijsko područje smješteno u atmosferu posude tako da se može vidjeti bez otvaranja. Komercijalni oblici razlikuju se: papirnate trakice, tablete koje se pri pripremi otapaju ili vlaže te noviji hibridni papiri. Nekima je za aktivaciju reakcijskog područja potrebna jedna kap destilirane vode. Drugi su suhi indikatori koji moraju ostati suhi. Mjerodavne su upute za konkretan proizvod jer su vlaženje, položaj i vrijeme očitanja dio kemijskog procesa.

Predviđeno očitanje u praksi je binarno. Plava boja znači da su na trakici i dalje prisutni kisik ili nedovoljno reducirajući uvjeti. Bijela boja ili bezbojnost znači da su na trakici uspostavljeni anaerobni redoks-uvjeti. Neki komercijalni papiri sadrže crveni pozadinski pigment, pa je njihov krajnji reducirani oblik ružičast, a ne bijel. Prije procjene upoznajte krajnju boju koju vaš proizvod treba postići.

Vrijeme ovisi o sustavu. U jednom sustavu tipa GasPak blijeđenje je počelo unutar približno jednog sata, a završilo unutar nekoliko sati, dok je u kontroliranoj usporedbi pri sobnoj temperaturi metilenskom modrilu trebalo više od šest sati. Redoks-potencijal hranjivih podloga u tom je istraživanju dosegnuo približno minus 100 milivolta unutar 60 do 100 minuta, znatno prije završetka promjene boje bojila, a do trenutka kada je trakica postala potpuno bezbojna bio je znatno ispod minus 200 milivolta. Indikator kasni za promjenom atmosfere. Plava trakica nakon jednog sata ne dokazuje neuspjeh, a bijela trakica nakon šest sati opisuje stanje trakice nakon šest sati.

Iz istog je razloga važan položaj. Držite trakicu u plinskom prostoru iznad sadržaja, vidljivu kroz poklopac, podalje od površina agara i hranjivih podloga. Ona pokazuje stanje u svojoj neposrednoj okolini. Ako je položite uz hladnu stijenku, zatrpate ispod ploča ili dopustite da je natopi kondenzat, pokazivat će stanje tog mikrookruženja, a ne posude.

Što trakica otkriva, a što ne

Indikator s metilenskim modrilom u anaerobnoj posudi promatrajte kao jedan senzor na jednom mjestu. On utvrđuje lokalne redoks-uvjete i prisutnost kisika u vlastitom reakcijskom području, koji su uglavnom reprezentativni za plinski prostor ako su miješanje i uspostavljanje ravnoteže odgovarajući. Sve izvan toga jest zaključivanje, a za zaključivanje su potrebni zasebni dokazi.

Bezbojna trakica ne potvrđuje sterilnost. Sterilnost je odsutnost živih organizama, dokazana validiranom sterilizacijom i kontrolama validacije uzgoja. Posuda može biti potpuno anaerobna, a ipak kontaminirana, ili potpuno sterilna, a ipak aerobna.

Trakica ne potvrđuje uvjete u svakom dijelu sustava za uzgoj. Otopljeni kisik u zatvorenoj epruveti, kisik zarobljen u dubokim slojevima agara, gradijenti u prenatrpanoj posudi i propuštanje koje nastane nakon očitanja izmiču jednoj trakici. Pokusi s prostornim rasporedom pokazali su susjedna plava i bezbojna područja u istoj posudi, u kojima su prodor kisika i redukcijska aktivnost bili različito uravnoteženi. Jedna točka ne može potvrditi uvjete u cijelom volumenu.

Trakica ne dokazuje neprekinute anaerobne uvjete. Trakica očitana jednom pri pripremi ne govori ništa o dvadesetom satu. Novija istraživanja kvalitete anaerobnih uvjeta upozoravaju da kemijski indikatori opisuju atmosferu u trenutku očitanja i mogu izgledati zadovoljavajuće unatoč maloj količini preostalog kisika. Kontinuirano dokumentiranje ili bilježenje na kontrolnim točkama, a ne jedan pogled na krajnje stanje, povezuje očitanje trakice s inkubacijom.

Za dodatno objašnjenje kemije promjene boje pogledajte kako metilensko modrilo prelazi između oksidiranog i reduciranog oblika. Za širi prikaz utjecaja kisika na rukovanje uzorcima pogledajte kontrolu kisika u mikroskopiji i uzgoju kultura.

Dijagram koji vrijedi držati uz posudu

Slika u nastavku sažima članak u jedan praktičan podsjetnik za laboratorijski stol. Prikazuje tri stanja iste trakice, dva smjera reakcije i granicu između dokaza koje pruža indikator i validacije sustava.

Uzroci neuspjeha zbog kojih trakica ostaje plava ili pruža lažnu sigurnost

Većina neuspjeha pripada jednoj od pet skupina. Svaka ima prepoznatljive znakove.

Posuda ili vrećica koja propušta neprekidno dovodi kisik u reakcijsko područje. Trakica ostaje plava ili nakon blijeđenja ponovno postaje plava. Prije nego što posumnjate u kemijski proces, provjerite poklopac, brtvu, stezaljke i brtvene površine.

Istrošen ili pogrešno aktiviran generator plina uopće ne uklanja kisik. U starijim sustavima koji se aktiviraju vodom, izostanak kondenzacije nakon približno 10 do 15 minuta i izostanak zagrijavanja poklopca nakon približno 20 do 40 minuta bili su rani znakovi problema za taj sustav. Vrećica nedovoljnog kapaciteta u prepunjenoj posudi zakazuje na isti način.

Trovanje katalizatora odnosi se samo na starije sustave s vodikom i paladijem, u kojima paladij omogućuje spajanje vodika i kisika u vodu. Vlaga i sumporovodik smanjuju njegovu aktivnost. Mnoge današnje vrećice uopće ne upotrebljavaju paladij, stoga nemojte primjenjivati takvo rješenje tamo gdje nije primjereno.

Oštećena trakica ili trakica kojom se nepravilno rukovalo može zakazati bez očitih znakova. Bojilo i redukcijsko sredstvo tijekom skladištenja gube reverzibilnost, što je jedan od razloga razvoja hibridnih formulacija otpornih na blijeđenje pod utjecajem svjetlosti i gubitak funkcionalnosti tijekom skladištenja. Odbacite zalihe kojima je istekao rok valjanosti, one s neuobičajenom početnom bojom te trakice koje su navlažene iako trebaju biti suhe ili ostavljene suhe iako zahtijevaju vlaženje.

Gradijent ili kašnjenje dovode u zabludu osobu koja očitava, a ne sam kemijski proces. Slabo izmiješan plinski prostor, zatvorene epruvete s otopljenim kisikom i polučvrste hranjive podloge zadržavaju vlastite uvjete dulje nego što trakica sugerira. Trakice s resazurinom prolaze kroz ružičasti oblik do bezbojnog i često se prodaju kao brže, ali njihovi pragovi ovise o vlastitoj formulaciji i ne mogu se prenijeti na metilensko modrilo.

Kontrole i protokol očitanja koji vrijedi preuzeti

Dvije jeftine kontrole otkrivaju većinu pogrešnih očitanja. Uz ispitivani sustav držite svježu kontrolnu trakicu izloženu zraku u prostoriji. Ispravna trakica s metilenskim modrilom u tim uvjetima ostaje plava. Neki zapakirani indikatori u početku su blijedi, a pri otvaranju postaju plavi, što je samo po sebi provjera funkcionalnosti. Povremeno stavite i svježu trakicu u prethodno validiran anaerobni sustav. Trebala bi postići validirano krajnje reducirano stanje unutar vremena navedenog za proizvod. Ako bilo koja kontrola ne reagira očekivano, zamijenite seriju prije nego što se pouzdate u očitanja iz posude.

Protokol očitanja proizlazi iz mehanizma djelovanja. Postavite trakicu u plinski prostor tako da bude vidljiva bez otvaranja posude, pridržavajući se uputa za proizvod u pogledu dodira sa stijenkom i vlaženja. Zabilježite početnu boju, vrijeme zatvaranja posude i boju u kontrolnom trenutku navedenom za proizvod. Ako posuda to omogućuje, na određenim kontrolnim točkama tijekom inkubacije zabilježite da je indikator ostao reduciran. Zabilježite završnu boju neposredno prije otvaranja. Ta boja prije otvaranja krajnje je očitanje za taj postupak. Nakon otvaranja očekujte ponovno pojavljivanje plave boje i nemojte dopustiti da ono promijeni prethodni zapis.

Ako trakica ostane plava nakon propisanog vremena, smatrajte anaerobne uvjete nepotvrđenima. Provjeravajte redom: brtvljenje, vrećicu, katalizator ako je prisutan, vlaženje i rok valjanosti indikatora, a zatim funkcionalnost indikatora u usporedbi s kontrolom na zraku. Tek nakon potvrde atmosfere treba tumačiti prisutnost ili odsutnost rasta, uz sustav za anaerobni uzgoj i kontrole mikroorganizama prilagođene primjeni.

Trakica zaslužuje posljednju riječ u svojem području. Plava ili bezbojna, odgovara na jedno pitanje o jednom mjestu u jednom trenutku. Postavite joj to pitanje u predviđeno vrijeme, uz odgovarajuće kontrole, i pouzdano će odgovoriti. Pitajte je o sterilnosti, o svakoj epruveti ili o cijeloj inkubaciji na temelju jednog pogleda i nikakva kemija indikatora neće spasiti takvo tumačenje.