Zašto se metilensko modrilo koristi kao kontrastno bojilo pri acidorezistentnom bojenju

Laboratorijski tehničar pregledava razmaz sputuma nakon cijelog postupka bojenja. Crveni štapići ističu se na plavoj podlozi, a u nalazu se navodi da su uočeni acidorezistentni bacili. Sljedećeg dana drugi preparat pokazuje jednoličnu plavu podlogu bez crvenih štapića, pa se nalaz izdaje kao negativan na tuberkulozu. Jedan od tih nalaza tvrdi više nego što preparat potkrepljuje, i to nije prvi.

Zabuna je pojmovna. Tehničar je plavo bojilo smatrao dijelom kemijskog procesa otkrivanja, kao da je metilensko modrilo pomoglo pronaći mikobakterije. Nije. Kad metilensko modrilo dođe u dodir s preparatom, test je već završen. Bojilo samo boji pozadinu kako bi rezultat bio čitljiv. Ovaj članak objašnjava ulogu metilenskog modrila u acidorezistentnom bojenju, zašto je plavo, a ne neke druge boje, te što se smije zaključiti iz crvene boje na plavoj pozadini.

Kratak odgovor

Acidorezistentno bojenje diferencijalni je test utemeljen na trima načelima. Karbol-fuksin, primarno bojilo, prisilno se unosi u svaku stanicu, uključujući mikobakterije s voštanom ovojnicom. Kiseli alkohol, sredstvo za odbojavanje, uklanja crveno bojilo iz običnih stanica, ali ga ne uspijeva izvući iz acidorezistentnih. Metilensko modrilo, kontrastno bojilo, zatim boji sve iz čega je sredstvo za odbojavanje uklonilo bojilo, pa neacidorezistentne stanice, stanice domaćina i stanični ostaci izgledaju plavo, dok acidorezistentni bacili ostaju crveni. Kontrastno bojilo osigurava kontrast. Ne sudjeluje u kemijskim svojstvima koja stanicu čine acidorezistentnom.

Što se događa u svakom koraku

Dijagram u nastavku prikazuje podjelu uloga. Čitajte ga slijeva nadesno kao postupak, a donju traku kao podsjetnik da svaka skupina metoda bojenja postavlja drukčije pitanje.

Prodiranje je prvi korak. Mikobakterije se opiru običnim vodenim bojilima jer im je ovojnica izrazito hidrofobna, pa se protokolom prisilno omogućuje ulazak bojila. U metodi po Ziehl-Neelsenu zagrijavanje do pojave pare potiskuje karbol-fuksin koji sadrži fenol kroz voštanu stijenku. U hladnoj metodi po Kinyounu zagrijavanje zamjenjuje znatno jača formulacija primarnog bojila, a neke modificirane inačice bez zagrijavanja uključuju i površinski aktivne tvari. Protokoli za acidorezistentno bojenje Američkog društva za mikrobiologiju usporedno navode obje formulacije, a razlika u koncentraciji je izrazita: približno 0.3 g bazičnog fuksina na 100 mL za metodu sa zagrijavanjem nasuprot približno 4 g za hladnu metodu.

Razlikovanje je drugi korak. Kiseli alkohol, obično 3 mL koncentrirane klorovodične kiseline u 97 mL 95-postotnog etanola, ispire crveno bojilo iz svake stanice čija stijenka ne pruža poseban otpor. Stanice s očuvanom mikobakterijskom lipidnom ovojnicom zadržavaju bojilo. Na tom se koraku temelji cijela metoda, a on je i najosjetljiviji na tehniku izvođenja, o čemu je riječ u nastavku.

Kontrast dolazi posljednji. Preparat sada sadrži crvene acidorezistentne stanice na gotovo bezbojnoj pozadini stanica iz kojih je bojilo uklonjeno. Metilensko modrilo u koncentraciji od 0.3 posto w/v ponovno čini tu pozadinu vidljivom, u boji koja se maksimalno razlikuje od crvene. Kontrastno bojenje je kratko, obično 20 do 30 sekundi u metodi sa zagrijavanjem i do nekoliko minuta u nekim inačicama hladne metode, a trajanje ovisi o protokolu, ne o svojstvu samog bojila.

Zašto baš ovo bojilo i zašto plavo

Metilensko modrilo kationsko je bazično bojilo, što znači da njegov obojeni ion nosi pozitivan naboj i veže se na negativno nabijene površine odbojenih bakterija, stanica domaćina i staničnih ostataka. OpenStax Microbiology opisuje tu logiku naboja kao opće načelo djelovanja bazičnih bojila. No metilensko modrilo ovdje nije kemijski jedinstveno. Kristal violet i safranin također su bazična bojila. Odabir je optički, a ne kemijski.

Crvenim štapićima potrebna je pozadina kontrastne nijanse, a plava se suprotstavlja crvenoj na način koji je najkorisniji za mikroskopiju u svijetlom polju. Safranin bi bio loše kontrastno bojilo jer je njegova završna ružičastocrvena boja previše slična zadržanom karbol-fuksinu, čime bi se poništila upravo ona razlika koju je postupak stvorio. Kristal violet dao bi tamnoljubičastu pozadinu koja bi odvlačila pozornost od tankih crvenih bacila. Najjači dokaz da je uloga kontrast, a ne kemijski učinak, jest mogućnost zamjene: zelena kontrastna bojila poput malahitnog zelenila i briljantnog zelenila koriste se u nekim veterinarskim i modificiranim protokolima, a test i dalje djeluje jer svaka jasno različita nijansa obavlja istu ulogu.

Iz toga proizlaze dvije praktične posljedice. Prvo, standardna receptura ne propisuje podešavanje pH; nemojte ovu običnu vodenu otopinu od 0.3 posto zamijeniti s alkalnim formulacijama poput Loefflerova metilenskog modrila, koje pripadaju drukčijem konceptu bojenja. Drugo, pretjerivanje šteti. Histološka literatura izričito upozorava da pretjerano intenzivna plava pozadina može prikriti malobrojne bacile, pa držanje preparata prekrivenog bojilom dulje nego što protokol dopušta smanjuje čitljivost bez ikakve koristi.

Kemija stijenke koja omogućuje test

Razlog zbog kojeg kiseli alkohol razlikuje stanice leži u mikobakterijskoj ovojnici. Njezinu strukturnu jezgru čini kompleks mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan: peptidoglikan povezan s arabinogalaktanom na čijim se vanjskim krajevima nalaze mikolne kiseline vrlo dugih lanaca, koje tvore vanjsku mikomembranu bogatu lipidima i izrazito slabo propusnu. Pregledni rad o vanjskoj membrani mikobakterija detaljno opisuje tu građu. Barijera djeluje u oba smjera. Odupire se ulasku bojila, zbog čega su za prodiranje potrebni zagrijavanje ili jače primarno bojilo, a odupire se i izvlačenju bojila, zbog čega kiseli alkohol ne uspijeva ukloniti karbol-fuksin nakon što uđe u stanicu. Obične bakterije nemaju tu ovojnicu i gube bojilo. Acidorezistentnost je stoga najbolje razumjeti kao pojavu povezanu s lipidnom barijerom, a ne kao kemijsko vezanje fuksina za mikolnu kiselinu.

Ta kemija objašnjava i čestu nedoumicu: mikobakterije se metodom po Gramu boje slabo i nepredvidivo, ponekad izgledajući kao blijedi zrnati oblici ili neobojene stanične sjene. Njihova hidrofobna stijenka ograničava prodiranje kristal violeta. Acidorezistentno bojenje nije modificirano bojenje po Gramu. Temelji se na drukčijem načelu razlikovanja i drukčijem svojstvu stijenke, kao što usporedba jednostavnog bojenja i bojenja po Gramu pokazuje za druge dvije metode.

Tri metode, tri pitanja

Za širu skupinu metoda bojenja bakterija jednim bojilom pogledajte atlas mikroskopskog bojenja.

Što crveno na plavoj pozadini ne može dokazati

Crveni štapići znače da su organizmi zadržali karbol-fuksin tijekom djelovanja kiselog alkohola. Takav je nalaz u skladu s bakterijom Mycobacterium tuberculosis, ali smjernice CDC-a za dijagnostiku tuberkuloze izričito navode da su i druge mikobakterije acidorezistentne, pa su za identifikaciju vrste potrebni uzgoj u kulturi i testiranje nukleinskih kiselina, a ne boja.

Pogreške u tehnici uglavnom se javljaju pri dvama ispiranjima. Nedovoljno odbojavanje ostavlja pozadinski materijal crvenim i pogoduje lažno pozitivnim očitanjima. Pretjerano odbojavanje uklanja slabo zadržano primarno bojilo i pridonosi lažno negativnim rezultatima. Preintenzivno kontrastno bojenje skriva malobrojne bacile u plavoj pozadini. Debeli razmazi, istaloženi reagensi i kontaminirana voda za ispiranje dodaju vlastite artefakte.

Osjetljivost je ograničena količinom organizama bez obzira na to koliko je tehnika besprijekorna. Konvencionalna mikroskopija razmaza zahtijeva približno 5,000 do 10,000 bacila po mililitru sputuma, a stariji pregledi dokaza CDC-a procjenjivali su osjetljivost razmaza na približno 45 do 80 posto među plućnim slučajevima potvrđenima kulturom. Negativan razmaz stoga nikada ne isključuje tuberkulozu. Aktualne smjernice CDC-a predviđaju uzgoj u kulturi uz svaki razmaz i preporučuju test amplifikacije nukleinskih kiselina na barem jednom respiratornom uzorku kada se razmatra plućna tuberkuloza i kada bi rezultat promijenio daljnje postupanje.

Praktičan rad mora slijediti odobrene protokole

Edukativni opisi, uključujući ovaj članak, ne daju ovlaštenje za klinički rad. Za praktičan laboratorijski rad slijedite validirani standardni operativni postupak laboratorija usklađen s aktualnim dokumentima CDC-a, APHL-a ili CLSI-ja; referentni dokument CDC-a o acidorezistentnom bojenju u njegovu arhivu Stacks pokazuje kako takvi postupci određuju reagense i način očitanja. Rad s uzorcima za tuberkulozu zahtijeva mjere biološkog zadržavanja: razmazi se pripremaju u kabinetu za biološku sigurnost jer priprema stvara aerosole i prskanje, a smjernice CDC-a za laboratorijsku sigurnost navode da čak i razmazi fiksirani toplinom mogu sadržavati žive bacile tuberkuloze te se s njima i dalje mora postupati kao s kontaminiranim materijalom. Zapis u CDC-ovoj biblioteci slika javnog zdravstva o razmazu obojenom karbol-fuksinom i metilenskim modrilom pregledanom radi otkrivanja M. leprae koristan je podsjetnik na primjenu metode i izvan tuberkuloze: isti kontrast crvenog na plavom služi svugdje gdje se traže acidorezistentni organizmi, a i pažljivo utvrđen negativan nalaz rezultat je koji vrijedi zabilježiti.

Očitavanje gotovog preparata

Kontrastno bojilo opravdava svoju ulogu tijekom početnog pregleda. Mikroskopist koji pregledava preparat pri malom povećanju najprije koristi plavu pozadinu za procjenu kvalitete razmaza: ravnomjerne raspodjele stanica, očuvanih stanica domaćina za fokusiranje i izostanka obilnog taloga. Crveni potencijalni bacili zatim privlače pogled upravo zato što ništa drugo na preparatu nije crveno. Potvrda se provodi uljnom imerzijom, pri kojoj pravi bacili pokazuju očekivani oblik tankih, katkad blago zakrivljenih ili zrnatih štapića, a ne jednoličnih ostataka bojila.

Bojenje pozadine određuje i izraze koji se koriste u nalazu. Za preparat s crvenim bacilima u nalazu se navodi da su uočeni acidorezistentni bacili, često uz semikvantitativnu ocjenu prema laboratorijskoj ljestvici. Za preparat bez crvenih organizama navodi se da nisu uočeni acidorezistentni bacili, nikada da je negativan na tuberkulozu. Ta je razlika važna jer plava podloga dokazuje da je bojenje uspjelo, da su stanice primile kontrastno bojilo i da su optički uvjeti bili odgovarajući, ali ne govori ništa o organizmima ispod granice detekcije. Plava podloga bez uočenih bacila valjan je rezultat o preparatu, a ne konačan sud o pacijentu.

Zapamtite podjelu uloga i formuliranje nalaza postaje jednostavno. Karbol-fuksin otkriva potencijalne bacile. Kiseli alkohol provodi test. Metilensko modrilo samo čini odgovor čitljivim: crveno je zadržalo bojilo unatoč kiselini, plavo ga je izgubilo. Sve ostalo, vrsta, količina organizama i kliničko značenje, proizlazi iz rada koji nadilazi sam preparat.