Objašnjenje Loefflerova alkalnog i polikromnog metilenskog modrila

Na laboratorijskom stolu za bojenje mogu stajati tri boce jedna pokraj druge, svaka označena kao neka varijanta metilenskog modrila. Na jednoj piše vodeno metilensko modrilo 1%. Na drugoj Loefflerovo alkalno metilensko modrilo. Na trećoj polikromno metilensko modrilo. Zaposlenik u žurbi posegne za onom koja mu je najbliža. Razmaz se zatim oboji preslabo, previše jednolično plavo ili neočekivanim nijansama ljubičaste, a za rezultat se okrivi uzorak.

Problem je u formulaciji, a ne u uzorku. Te tri otopine sadržavaju srodna bojila, ali temelje se na različitim načelima bojenja. Jedna je obično kationsko bojilo pri gotovo neutralnom pH. Druga je isto bojilo kojem je djelovanje pojačano lužinom. Treća više uopće nije jedno bojilo, nego namjerno oksidirana smjesa. Upotrijebite li pogrešnu, mijenja se načelo bojenja tijekom vašeg rada.

Kratak odgovor

Obično vodeno metilensko modrilo polazišna je formulacija: oko 1% bojila u vodi, jednostavno kationsko bojilo za prikaz bakterijske morfologije i opću mikroskopiju. U Loefflerovu alkalnom metilenskom modrilu alkoholnoj matičnoj otopini razrijeđenoj vodom dodaje se mala, odmjerena količina razrijeđene lužine, čime se povisuje pH i pojačava vezanje kationskog bojila na kisele bakterijske strukture. Polikromno metilensko modrilo jest metilensko modrilo koje je namjerno podvrgnuto sazrijevanju oksidacijom u lužnatom mediju, pa boca sadržava smjesu demetiliranih homologa (azure A, azure B, azure C), tionina i metilenskog ljubičastog uz preostalo metilensko modrilo, a ta smjesa boji različite strukture različitim nijansama.

Ako zapamtite samo jednu rečenicu: alkalizacija mijenja intenzitet bojenja, dok polikromiranje mijenja boje pri bojenju.

Obično vodeno metilensko modrilo: referentna točka

Najjednostavnija formulacija jest metilensko modrilo otopljeno u vodi, obično u koncentraciji 1% w/v, bez lužine i bez oksidacije. Obojena kemijska vrsta jest metiltioninijev kation s kloridnim protuionom, malo planarno fenotiazinsko bojilo koje je u PubChemovu zapisu o metilenskom modrilu opisano kao metiltioninijev klorid. Kao kation veže se na fosfatnu okosnicu nukleinskih kiselina i kisele skupine na bakterijskim staničnim stijenkama te boji stanice plavo na svijetloj podlozi.

Njegova je prednost predvidljivost. Jezgre i bakterije izgledaju plavo. Kontrast je umjeren. Slabo uočljivi mikroorganizmi mogu se slabo obojiti, a upravo je to ograničenje Loeffler nastojao ukloniti. Za širu skupinu jednostavnih bakterijskih bojila kojoj pripada ova otopina pogledajte pregled jednostavnog bojenja bakterija. I ovdje je važno precizno utvrditi identitet: metilno modrilo posve je drukčija molekula, kako objašnjava članak metilno modrilo nasuprot metilenskom modrilu, pa pretraživanje kataloga samo prema nazivu boje može dovesti do pogrešne skupine bojila.

Loefflerovo alkalno metilensko modrilo: isto bojilo, snažnije djelovanje

Klasična Loefflerova receptura kombinira alkoholnu matičnu otopinu metilenskog modrila s razrijeđenom lužinom u vodi. Udžbeničke verzije propisuju 0.3 g bojila u 30 mL 95% etanola uz 100 mL 0.01% vodene otopine kalijeva hidroksida (ili, ekvivalentno, 30 mL zasićene alkoholne otopine metilenskog modrila, 100 mL destilirane vode i 1 mL 1% KOH), čime se dobiva radna otopina s približno 0.3% bojila pri izrazito alkalnom pH. Komercijalne verzije slijede isto načelo, a katalog mikrobioloških bojila tvrtke Thermo Fisher navodi Loefflerovo alkalno metilensko modrilo uz polikromnu i vodenu varijantu kao zasebne kataloške proizvode s različitim namjenama.

Ključna je lužina. Povišenje pH deprotonira karboksilne i fosfatne skupine u uzorku, povećavajući gustoću negativno nabijenih mjesta, dok alkoholna matična otopina održava bojilo potpuno otopljenim tako da na ta mjesta dolazi u monomernom obliku. Rezultat je brže i intenzivnije bojenje bakterija nego neutralnim vodenim bojilom, uz prepoznatljive tamnoplave štapiće i koke rutinskog bakteriološkog razmaza. Bojenje obično traje jednu do tri minute, nakon čega slijedi ispiranje vodom.

Klasična je primjena bojenje bakterije Corynebacterium diphtheriae uzgojene na Loefflerovoj serumskoj podlozi: vitkih, često batinastih štapića s jako obojenim metakromatskim Babes-Ernstovim granulama pohranjenog polifosfata. Povezanost podloge i bojila povijesna je, oboje se pripisuje istom bakteriologu, a kontrast granula donosi dijagnostičku korist. Osim u radu s difterijom, ovo bojilo služi kao opće bakteriološko bojilo za razmaze iz kultura, za prikaz morfologije bakterija roda Neisseria u kliničkim razmazima i svugdje gdje bojenje po Gramu nije potrebno, ali obično vodeno modrilo daje preslabo obojenje. To je monokromno bojilo. Sve kisele strukture poprime neku nijansu plave. Kada protokol zahtijeva razlikovanje bojom, sama lužina to ne može omogućiti.

Jedno praktično upozorenje: alkalne otopine bojila propadaju i stvaraju talog tijekom skladištenja i apsorpcije ugljikova dioksida. Laboratoriji zato pripremaju manje količine ili kupuju katalošku otopinu i poštuju njezin rok valjanosti, umjesto da nastavljaju koristiti staru bocu iz koje talog sada dospijeva na svako predmetno stakalce.

Polikromno metilensko modrilo: jedan naziv, više bojila

Polikromno metilensko modrilo polazi od istog bojila, ali ga podvrgava kontroliranoj oksidaciji u lužnatom mediju, povijesno nazvanoj sazrijevanjem ili polikromiranjem. Starenje u lužnatom mediju, zagrijavanje s karbonatom ili oksidacija sredstvima poput dikromata postupno uklanjaju metilne skupine s dimetilaminskih supstituenata. Proizvod je smjesa: preostalo metilensko modrilo uz azure B (s jednom uklonjenom metilnom skupinom), azure A i azure C (daljnja demetilacija), tionin (potpuno demetiliran) i oksidacijske nusproizvode iz skupine metilenskog ljubičastog. Svaka komponenta ima vlastitu nijansu i afinitet prema tkivima, pa smjesa boji metakromatski: jezgre, granule, mucini i hrskavica poprimaju različite tonove od plave do crvenoljubičaste.

Isti kemijski procesi stoje iza poznatih bojila za krvne razmaze. Rani istraživači otkrili su da alkalizirano metilensko modrilo boji jezgre parazita malarije nijansama ljubičaste, ali njihove vodene otopine sazrelog bojila bile su nestabilne i stvarale su talog u roku od nekoliko dana. Pregled kako je izumljeno ljubičasto bojilo za krvne razmaze opisuje kako su Malachowski i Romanowsky neovisno iskoristili taj učinak 1891., kako je uveden metanol radi stabilizacije taloga bojila i fiksiranja razmaza bez zagrijavanja te kako je Giemsa kasnije standardizirao smjesu na temelju odmjerene količine azure B i eozina, uz stabilizaciju glicerolom. Suvremena bojila tipa Giemsa izravno potječu od kombinacije polikromnog metilenskog modrila i eozina, koja stvara učinak Romanowskog. Za pojedinosti o kombinaciji s eozinom i komponenti azure B pogledajte bojila tipa Romanowsky i interakciju azure B s eozinom.

Budući da je smjesa, polikromno metilensko modrilo po svojoj je prirodi najmanje standardizirano od ove tri formulacije. Njegova točna ravnoteža nijansi ovisi o postupku i stupnju oksidacije, zbog čega ga dobavljači histoloških proizvoda prodaju kao zaseban proizvod s vlastitim ispitivanjima svojstava, a ne kao ostarjelo Loefflerovo bojilo. Uobičajene primjene uključuju metakromatski prikaz granula mastocita, mucina i hrskavice, detalja plazma-stanica te bakterije Helicobacter pylori u tkivnim rezovima polikromnim metodama tipa Goodpasture. Pravi je izbor kada se traži razlikovanje bojom, a pogrešan kada protokol očekuje jasnu monokromnu siluetu bakterija.

Usporedba formulacija i namjena

Čitajte tablicu kao postupak za donošenje odluke. Ako se uzorak boji preslabo, promijenite pristup pH i posegnite za Loefflerovim bojilom. Ako se sve oboji, ali se ništa međusobno ne razlikuje, promijenite vrstu bojila i posegnite za polikromnim. Ako razmaz obojen Loefflerovim bojilom izvrsno prikazuje granule, ali nadređeni pita zašto su jezgre i citoplazma jednako plave, odgovor je da nijedno alkalno monokromno bojilo ne može ostvariti takvo razlikovanje. To je zadatak za polikromnu skupinu i njezina izvedena bojila za krvne razmaze.

Kako izbjeći uobičajene zabune

Dvije su pogreške odgovorne za većinu zabuna. Prva je pretpostavka da je Loefflerovo bojilo zamjenjivo s običnim metilenskim modrilom jer oba u boci izgledaju plavo. Razlikuju se po pH i intenzitetu, a zamjenom Loefflerova bojila neutralnim ondje gdje je ono propisano gubi se upravo onaj kontrast granula zbog kojeg je protokol osmišljen. Druga je pogreška smatrati bilo koje staro ili slučajno ostarjelo alkalno modrilo polikromnim. Nekontrolirano starenje stvara nepoznatu smjesu nepoznate jakosti, dok se prave polikromne otopine pripremaju definiranim oksidacijskim postupcima i, u skupini bojila za krvne razmaze, kombiniraju s odmjerenim eozinom. Povijest je ovdje poučna: nestabilne vodene otopine sazrelog bojila iz 1890-ih zamijenjene su metanolnim stabiliziranim formulacijama upravo zato što se nekontrolirane smjese nisu mogle reproducirati. Vrijedi se prisjetiti te pouke prije bojenja dijagnostičkog stakalca bojilom iz boce nepoznate starosti.

Precizno razlikovanje naziva zaokružuje priču. Na etiketi provjerite kataloški proizvod (vodeno, Loefflerovo ili polikromno bojilo), udio bojila i predviđenu primjenu, umjesto da zaključujete prema boji. Te tri formulacije dijele zajednički ishodišni kromofor. Ne dijele istu namjenu.