Jednostavno bojenje metilenskim modrilom u usporedbi s bojenjem po Gramu: što svaka metoda može dokazati

Student priprema razmaz iz kulture označene kao E. coli, prelijeva ga metilenskim modrilom na jednu minutu, ispire i promatra kroz imerzijski objektiv. Vidno polje prekrivaju plavi štapići. U laboratorijskom izvješću piše: „Gram-negativni štapići identificirani kao E. coli.” Opažanje je točno. No taj preparat ne opravdava zaključak.

Pogreška je pojmovna, a ne tehnička. Student je jednostavno bojenje tretirao kao diferencijalni test. Jednostavno bojenje i bojenje po Gramu odgovaraju na različita pitanja jer se temelje na različitim načelima bojenja. Prvo pita: koji je oblik prisutan. Drugo pita: kako se stanična stijenka ponaša pri određenom postupku. Zamijenite li ta dva postupka, ispravno obojen preparat dovest će do neutemeljenog izvješća.

Ova usporedba jasno razdvaja te dvije metode, pokazuje koje tvrdnje opravdava svaki rezultat i odgovara na dva pitanja koja studenti najčešće postavljaju: može li se metilensko modrilo upotrebljavati u bojenju po Gramu i što bojenje E. coli metilenskim modrilom zapravo pokazuje.

Kratak odgovor

Jednostavno bojenje metilenskim modrilom boji svaku stanicu koja se može obojiti istom plavom bojom, pa otkriva morfologiju (štapići, kuglice, spirale) i raspored (pojedinačno, u parovima, u lancima), ali ništa o kategoriji prema Gramu. Bojenje po Gramu uključuje jod, korak odbojavanja i kontrastno bojilo, pa razdvaja bakterije na Gram-pozitivne (ljubičaste) i Gram-negativne (ružičaste ili crvene) prema tome kako njihove ovojnice zadržavaju bojilo. Plavi štapići nakon bojenja metilenskim modrilom znače „prisutne su stanice štapićastog oblika”. Ružičasti štapići nakon cjelovitog postupka bojenja po Gramu znače „prisutni su Gram-negativni štapići”. Druga je tvrdnja snažnija jer je postupkom proveden dodatni test.

Za širu skupinu metoda bojenja bakterija jednim bojilom, kojoj pripada i ovaj članak, pogledajte atlas mikroskopskog bojenja.

Jednostavno bojenje: jedno bojilo, jedno pitanje

Metilensko modrilo je bazično (kationsko) bojilo. Njegov obojeni ion nosi pozitivan naboj i veže se na negativno nabijene strukture u stanici, uključujući nukleinske kiseline i kisele površinske skupine, pa stanice izgledaju plavo na svijetloj pozadini. OpenStax opisuje to načelo pozitivnog bojenja u svojem poglavlju o bojenju. Sam kation bojila mali je, plosnati fenotiazinski ion detaljno opisan u referentnom članku o kemiji metilenskog modrila; kloridni protuion ne sudjeluje u bojenju.

Standardni nastavni protokol namjerno je jednostavan: napravite tanak razmaz, osušite ga na zraku, fiksirajte toplinom, prelijte približno 1% vodenom otopinom metilenskog modrila na otprilike jednu minutu, nježno isperite vodom, osušite upijanjem i pregledajte uz uljnu imerziju. Nastavni protokol na LibreTextsu navodi upravo taj postupak s 1% otopinom tijekom jedne minute, uz napomenu da neki laboratoriji produljuju vrijeme. Nema močila, nema sredstva za odbojavanje, nema drugog bojila. Upravo je u tome smisao. Uz samo jedno bojilo i bez selektivnog uklanjanja svaka stanica koja veže bojilo na kraju poprimi istu boju.

Kod E. coli očekivano vidno polje sadrži plave štapiće (bacile), pojedinačno, u parovima ili u malim skupinama. Plava boja potječe od bojila. Štapićast oblik potječe od organizma. No ta kombinacija ne identificira organizam jer su mnoge vrste štapićaste, a mnogi se štapići pri jednostavnom bojenju oboje plavo. ATCC u svojem vodiču za uzgoj mikroorganizama izričito navodi to ograničenje na samu morfologiju. Ispravno izvješće glasi: „opaženi su plavi bacili”. Sve što nadilazi oblik i raspored zahtijeva dodatne dokaze.

Bojenje po Gramu: četiri reagensa, jedan test ponašanja

Bojenje po Gramu je diferencijalno bojenje. Sve stanice podvrgava istom slijedu koraka i pokazuje koje zadržavaju prvo bojilo, a koje ga gube. Protokoli Američkog društva za mikrobiologiju za bojenje po Gramu definiraju standardni redoslijed od četiri koraka: kristal-violet (primarno bojilo), Gramov jod (močilo), alkohol ili smjesa acetona i alkohola (sredstvo za odbojavanje), zatim safranin (kontrastno bojilo).

Standardni nastavni model objašnjava tu razliku građom ovojnice. Gram-pozitivne stanice imaju debelu peptidoglikansku stijenku koja dehidrira i zadržava kompleks kristal-violeta i joda tijekom ispiranja alkoholom. Gram-negativne stanice imaju tanak peptidoglikanski sloj i vanjsku membranu bogatu lipidima koju sredstvo za odbojavanje narušava, pa se kompleks ispire, a stanice zatim primaju safranin. Pregled bojenja po Gramu na NCBI Bookshelfu donosi to objašnjenje temeljeno na staničnoj stijenci. Stručnjaci dodaju da je ukupna fizikalna kemija složenija od same debljine stijenke, ali za laboratorijsko tumačenje vrijedi pravilo ponašanja: ljubičasto znači da je bojilo zadržano, a ružičasto da je izgubljeno i zatim zamijenjeno kontrastnim bojilom.

Ilustrativni prikazi. Stilizirani crteži za usporedbu metoda, a ne mikrografije snimljene kamerom. Boje su pojednostavljene kako bi objasnile logiku: jedna boja pri jednostavnom bojenju, dvije boje nakon odbojavanja u postupku po Gramu.

Može li se metilensko modrilo upotrebljavati u bojenju po Gramu

To se pitanje može tumačiti na dva načina, a svaki zahtijeva drukčiji odgovor.

Prvo tumačenje: može li jedno prelijevanje metilenskim modrilom zamijeniti cijeli postupak bojenja po Gramu. Ne. Bez joda, sredstva za odbojavanje i kontrastnog bojila nema diferencijalnog koraka, pa se kategorija prema Gramu ne ispituje. Plavo vidno polje nakon uporabe samo metilenskog modrila rezultat je jednostavnog bojenja, čak i ako bočica stoji pokraj reagensa za bojenje po Gramu. Nemojte ga bilježiti kao rezultat bojenja po Gramu.

Drugo tumačenje: može li metilensko modrilo zamijeniti safranin kao kontrastno bojilo u koraku 4. Funkcionalno može obojiti odbojene stanice, a udžbenička vježba predviđa ljubičaste Gram-pozitivne stanice i plave Gram-negativne stanice nakon takve zamjene. Logika je valjana jer su pravilno odbojene Gram-negativne stanice gotovo bezbojne i primit će drugo kationsko bojilo. No to nije standardni protokol. Protokoli ASM-a propisuju safranin, uz priznate alternative poput bazičnog fuksina u nekim inačicama, a ne metilensko modrilo. Postoji i praktičan nedostatak: plavu je teže razlikovati od ljubičaste nego ružičastu od ljubičaste, osobito početnicima i osobito pri slabijem svjetlu dotrajalih mikroskopskih lampi. Za nastavne vježbe i svaki rezultat koji je važan upotrebljavajte kontrastno bojilo navedeno u protokolu, obično safranin, a metilensko modrilo kao kontrastno bojilo smatrajte demonstracijskom inačicom, a ne jednakovrijednim standardom.

Povezano pitanje usporedbe metilenskog modrila s drugim mogućnostima bojenja jednim bojilom obrađeno je u usporedbi jednostavnih bojenja bakterija.

Što bojenje E. coli metilenskim modrilom dokazuje, a što ne

E. coli je Gram-negativan štapić, ali ta rečenica objedinjuje činjenice dobivene različitim metodama: morfologiju iz mikroskopije, reakciju po Gramu iz bojenja po Gramu te identitet iz uzgoja u kulturi i biokemijskog ili molekularnog ispitivanja. Razmaz obojen metilenskim modrilom daje samo prvi dio. Potvrđuje da su u obojenom uzorku prisutne stanice štapićastog oblika i pokazuje njihov raspored. Ne utvrđuje reakciju po Gramu jer nije proveden korak odbojavanja. Ne identificira vrstu jer štapići mnogih vrsta pri toj razlučivosti izgledaju slično.

Upravo tu izvješća griješe na predvidljiv način. Autor unosi prethodno znanje („ova bi kultura trebala biti E. coli, a E. coli je Gram-negativna”) u zapis opažanja, pa se čini da preparat potvrđuje ono što je zapravo pretpostavljeno. Jasnije izvješće razdvaja te razine: „Jednostavno bojenje metilenskim modrilom: opaženi su plavi bacili; samo morfologija, kategorija prema Gramu nije ispitana.” Zatim, ako je bojenje po Gramu pravilno provedeno uz kontrole: „Bojenje po Gramu: ružičasti štapići, što je u skladu s Gram-negativnom reakcijom.” Identitet vrste utvrđuje se poslije, postupkom identifikacije, a ne samo na temelju boje.

Praktičan vodič za tumačenje

Pri laboratorijskom radu primijenite ovo pravilo odlučivanja. Ako su sve stanice jedne boje, a protokol je uključivao jedno bojilo bez sredstva za odbojavanje, proveli ste jednostavno bojenje. Zabilježite oblik, procjenu veličine i raspored. Tu stanite. Ako je protokol uključivao kristal-violet, jod, sredstvo za odbojavanje i kontrastno bojilo uz poznate pozitivne i negativne kontrole, proveli ste bojenje po Gramu. Zabilježite boju i morfologiju: ljubičasti koki u lancima, ružičasti štapići i tako dalje.

Tri pogreške uzrokuju većinu zabune. Prva je pretjerano tumačenje plavih štapića kao potvrde E. coli. Druga je bilježenje preparata obojenog metilenskim modrilom pod naslovom „Bojenje po Gramu” u bilježnici, što će kasniji čitatelji pogrešno protumačiti. Treća je olaka zamjena kontrastnih bojila i zatim uspoređivanje boja među laboratorijima kao da su palete jednake. Sve tri pogreške imaju isto rješenje: navedite metodu koja je stvarno provedena i tvrdite samo ono što se tom metodom ispituje.

Jednostavno bojenje opravdava svoju ulogu upravo zato što daje ograničene zaključke. Brzo je, podnosi manja odstupanja u izvedbi i dovoljno je kada je pitanje morfološko: ima li čega i kakva je oblika. Kada je pitanje klasifikacija, provedite diferencijalni test. Plavi preparat govori vam kako stanice izgledaju. Ljubičasti ili ružičasti preparat govori vam kako se njihove stijenke ponašaju. Nijedan preparat sam za sebe ne otkriva vrstu.