Bojenje stanica sluznice obraza metilenskim modrilom: što promatrati

Učenica stavlja kap suspenzije stanica sluznice obraza na predmetno stakalce, pogleda kroz mikroskop i ne vidi gotovo ništa. Nekoliko blijedih obrisa pluta svijetlim vidnim poljem. Pokušava izoštriti sliku, zatim pojačava osvjetljenje i naposljetku zaključuje da je preparat prazan. Preparat nije prazan. Stanice su tu. Gotovo su prozirne, a upravo je prozirnost problem koji ovo bojenje treba riješiti.

Taj nesklad između očekivanja i slike vrijedi objasniti prije početka postupka. Početnici očekuju da će mikroskop otkriti pojedinosti onako kako zumiranje kamerom otkriva udaljeni natpis. Mikroskop sa svijetlim poljem radi nešto određenije: prikazuje razlike u apsorpciji svjetlosti. Neobojena stanica sluznice obraza gotovo uopće ne apsorbira svjetlost pa stvara vrlo malu razliku. Metilensko modrilo dodaje tu razliku. Veže se unutar stanice, neravnomjerno, i pretvara strukturu u kontrast. Kad učenici shvate taj koncept, svaki sljedeći korak postaje njegova posljedica, a ne samo uputa iz recepta.

Pomaže poznavanje načina na koji jednostavna bojenja stvaraju kontrast u školskom laboratoriju, a ponavljanje postavljanja mikroskopa sa svijetlim poljem prije bojenja sprječava polovicu neuspjelih preparata. Kemija koja stoji iza boje obrađena je u uvodu u metilensko modrilo u mikroskopiji, koji objašnjava zašto se upravo to bojilo tako često nalazi na laboratorijskom stolu.

Protokol za nastavu

Verzija s mokrim preparatom u nastavku jednostavniji je standardni izbor za opću nastavu. Ne zahtijeva plamen ni fiksaciju. Varijanta s fiksiranim razmazom, koja se koristi u nekim visokoškolskim priručnicima, uključuje sušenje na zraku i kratku toplinsku fiksaciju, kao u vježbi izrade razmaza sluznice obraza koledža North Central Texas College objavljenoj na platformi Biology LibreTexts, no toplinska fiksacija uobičajena je praksa u mikrobiologiji, a ne uvjet za promatranje epitelnih stanica.

Potrebno je: čista predmetna i pokrovna stakalca, sterilni jednokratni štapići za uzimanje brisa (poželjno) ili nove plosnate čačkalice, bočica s kapaljkom s 0.5 do 1 posto vodenom otopinom metilenskog modrila, destilirana ili deionizirana voda, upijajući papir, rukavice i složeni svjetlosni mikroskop s ukupnim povećanjima 100x i 400x.

1. Isperite usta običnom vodom. Time uklanjate čestice hrane koje se poslije intenzivno oboje i odvraćaju pozornost od stanica.
2. Svaki učenik uzima uzorak samo s unutarnje strane vlastitog obraza. Nježno protrljajte unutarnju stranu obraza novim sterilnim štapićem. Pritisnite, nemojte strugati. Prestanite znatno prije pojave bilo kakve nelagode ili krvarenja.
3. Tanko razmažite uzorak kotrljajući štapić preko sredine čistog predmetnog stakalca. Tanak sloj najvažniji je čimbenik za dobivanje preglednog preparata. Debela bijela naslaga obojit će se u nepreglednu plavu masu.
4. Dodajte jednu kap metilenskog modrila na razmaz. Ostavite ga 1 do 3 minute. U mnogim visokoškolskim protokolima dovoljna je jedna minuta; NCERT-ov laboratorijski priručnik iz prirodoslovlja za IX. razred predviđa oko 3 minute za privremeni preparat. Dulje nije bolje, a prekomjerno bojenje najčešća je pogreška u određivanju vremena.
5. Nježno isperite destiliranom vodom ili uklonite višak bojila upijajućim papirom, prema lokalnom protokolu. Pozadina bi trebala postati blijedoplava, a ne tamnoplava.
6. Spustite pokrovno stakalce pod kutom tako da najprije dodirne površinu jednim rubom, a zatim ga polako spustite do kraja. Time sprječavate nastanak mjehurića zraka.
7. Počnite s malim povećanjem kako biste pronašli stanice, provjerite izoštrenost i položaj u središtu vidnog polja, zatim prijeđite na 100x i naposljetku na 400x. Pri 400x koristite samo vijak za fino izoštravanje.

Koncentraciju bojila vrijedi precizirati jednom rečenicom. Školski protokoli uglavnom koriste 1 posto vodenu otopinu metilenskog modrila. Jača početna otopina ili dulje izlaganje brže potamnjuju pozadinu nego jezgru, čime se preokreće kontrast na kojem se vježba temelji.

Sigurno rukovanje uzorcima sluznice obraza

Uzorci sluznice obraza sadrže slinu i normalne mikroorganizme usne šupljine, pa svaki svježi razmaz tretirajte kao potencijalno zarazan materijal, iako su davatelji uzoraka zdravi učenici iz razreda. Smjernice Američkog društva za mikrobiologiju o biološkoj sigurnosti u nastavnim laboratorijima navode opća načela: procijenite rizik prije vježbe, nosite rukavice, zaštitite oči kada postoji mogućnost prskanja, nakon rada operite ruke, dezinficirajte radne površine i odložite kontaminirani jednokratni pribor prema odobrenom postupku zbrinjavanja biološkog otpada.

Četiri nastavna pravila pokrivaju većinu rizika. Jedan davatelj uzorka po štapiću i po stakalcu; nikada ih ne dijelite. Uzimajte samo vlastiti uzorak, nikada uzorak druge osobe. Jednokratni štapići i čačkalice idu izravno u predviđeni spremnik za otpad, nikada natrag na radni stol. Samo metilensko modrilo boji kožu i odjeću te nadražuje oči, pa treba nositi rukavice i primjenjivati uobičajene mjere opreza pri radu s bojilima. Nemojte proširivati ovu vježbu na uzgoj bilo čega iz razmaza i nemojte improvizirati toplinsku fiksaciju svježeg ljudskog materijala izvan školskog sigurnosnog postupka.

Što promatrati i zašto tako izgleda

Pri 100x potražite široke, plosnate, blijedoplave stanice nepravilnih ovalnih ili mnogokutnih obrisa. Nalaze se pojedinačno ili u rahlim slojevima koji se preklapaju. Svaka stanica obično ima jednu tamnoplavu točku. Ta je točka jezgra. Obratite pozornost i na raspored: pločaste epitelne stanice nalik su tankim pločicama, a ne kuglama, zbog čega njihovi rubovi izgledaju poput ispucale glazure, a ne okruglih balona.

Pri 400x jasno se razaznaju tri obilježja. Granica stanice vidi se kao tanka tamnija crta koja je okružuje. Citoplazma ispunjava unutrašnjost svijetlom, ujednačenom plavom bojom. Jezgra je tamnija i kompaktnija, često ovalna, obično blizu središta, ali ne uvijek. Zamolite učenike da zabilježe sva tri obilježja te oblik i povećanje jer se upravo to traži na radnom listu.

Ovdje je važna jedna pojedinost za točnost, a mnogi je radni listovi pogrešno prikazuju. Vidljiva granica odgovara području plazmatske membrane, ali sama membrana, lipidni dvosloj debljine približno 7 do 10 nanometara, daleko je ispod granice razlučivosti školskog mikroskopa. Učenici vide optički rub stanice i bojilo koje se ondje nakupilo. Isti oprez vrijedi i za organele. Mitohondriji, endoplazmatski retikulum, Golgijev aparat i ribosomi nisu vidljivi u ovom preparatu. U dobrim uvjetima konvencionalni svjetlosni mikroskop može razlučiti pojedinosti veličine približno 0.2 mikrometara, kako objašnjava NCBI-jev pregled mikroskopskih alata u staničnoj biologiji, a većina ultrastrukture nalazi se ispod ili blizu te granice. Veće prazno povećanje povećava sliku, ali ne dodaje pojedinosti.

Zašto se jezgra oboji najtamnije? Metilensko modrilo kationsko je bojilo, pozitivno nabijeno u otopini, koje se povezuje s negativno nabijenim materijalom u stanici, prije svega s nukleinskim kiselinama. Kromatin koncentrira DNA u jezgri, pa jezgra nakuplja najviše bojila. Citoplazma sadrži RNA i druge nabijene molekule, pa se i ona boji, ali difuznije i svjetlije. Ključna napomena: metilensko modrilo nije bojilo specifično za DNA. Rad o raspodjeli metilenskog modrila pri snimanju staničnih jezgara opisuje povezivanje kationa s područjima bogatim nukleinskim kiselinama, a starije kvantitativno istraživanje o vezanju metilenskog modrila u staničnim preparatima utvrdilo je da je većina vezanog bojila povezana s nukleinskim kiselinama. Tamna jezgra uz svijetlu citoplazmu stoga je obrazac kontrasta, a ne molekularna analiza.

Pogreške koje će učenici napraviti i kako ih prepoznati

Gotovo svaki neuspjeli preparat pripada jednom od pet obrazaca. Naučite učenike da utvrde problem s preparatom umjesto da ga naslijepo ponovno izrađuju.

Prekomjerno bojenje čini stanice i pozadinu jednoliko tamnima, pa se jezgra gubi u vidnom polju. To ispravite kraćim vremenom bojenja ili temeljitijim ispiranjem. Nedovoljno bojenje ostavlja blijede obrise koji nestaju kad se pojača osvjetljenje; produljujte vrijeme u koracima od trideset sekundi. Debeli razmazi stvaraju guste mase preklopljenih stanica u kojima se ne može pratiti nijedan obris; rješenje je mehaničko: sljedeći put razmažite tanji sloj jer nikakvo ispiranje ne može popraviti hrpu stanica. Mjehurići zraka izgledaju kao savršeni krugovi s oštrim tamnim rubovima i odvraćaju pozornost početnika koji ih zamjenjuju za strukture; ponovno polako postavite pokrovno stakalce pod kutom. Sitne tamne točkice raspršene po stanicama ili oko njih obično su normalne bakterije usne šupljine, kako navode školski protokoli poput postupka za promatranje stanica sluznice obraza na stranici Ingrid Science. One potvrđuju da u ustima žive mikroorganizmi, što učenicima može ostati u sjećanju, ali ovom vježbom nije moguće odrediti njihovu vrstu i ne treba ih crtati kao dijelove stanice. Ostaci hrane i niti sluzi boje se nepravilno i intenzivno; prethodno ispiranje služi njihovu smanjenju.

Što ova vježba ne može pokazati

Ovo je obrazovno promatranje, a ne dijagnostički test. Na temelju izgleda stanica obojenih u nastavi ne mogu se dijagnosticirati infekcija, rak ni bilo koja bolest, a članak ne treba tumačiti kao da sugerira suprotno. Preparat prikazuje oblik, granicu, citoplazmu i jezgru pri dva povećanja. Ne prikazuje ultrastrukturu membrane, pojedinosti organela ni molekularni identitet. Jasno navođenje ograničenja štiti i znanost i učenike: dobar rezultat jest pravilno označen crtež sa zabilježenim povećanjem i bojilom, a ne zaključak o zdravlju.

Radni list za učenike i označene mikrografije

Dva projektna materijala za ovu stranicu jesu označena mikrografija iznad i radni list u nastavku. Ispišite po jedan radni list za svakog učenika ili ga projicirajte i zamolite učenike da precrtaju okvire u bilježnice.

Kako ga upotrijebiti tijekom 45 minuta nastave: deset minuta za sigurnosne upute i uzimanje uzorka, deset minuta za bojenje i postavljanje pokrovnog stakalca, petnaest minuta za promatranje i skiciranje pri oba povećanja te deset minuta za kontrolni popis i usporedbu s označenom mikrografijom. Stavke kontrolnog popisa namjerno su konkretne. Tanak razmaz, pravilno vrijeme bojenja, jezgra tamnija od citoplazme, zabilježeno povećanje. Učenik koji može potvrditi sve četiri stavke razumio je koncept kojem ova nastavna vježba služi: mikroskopi prikazuju razlike, a bojenja stvaraju razlike koje vrijedi prikazati.