ઝીબ્રાફિશ સંશોધનમાં મિથિલીન બ્લૂ: ઉછેર માટેનો ઉમેરણ પદાર્થ અને પ્રયોગનાં પરિણામોને ગૂંચવતું પરિબળ

ઝીબ્રાફિશનાં ઈંડાંનું પાણી ઘણી વાર આછું વાદળી હોય છે, અને તેનું કારણ ભાગ્યે જ કોઈ નોંધે છે. આ રંગદ્રવ્ય મિથિલીન બ્લૂ છે, જે ફૂગ સામે ઉમેરવામાં આવે છે, અને મોટાભાગની કાર્યપદ્ધતિઓ તેને પૃષ્ઠભૂમિનો ભાગ માને છે. અહીં પૃષ્ઠભૂમિ એ ખોટો ખ્યાલ છે. વધુ યોગ્ય ખ્યાલ છે: નોંધાયા વિનાનું પ્રાયોગિક પરિબળ. એવું કંઈક, જે ઉપચાર આપવામાં આવેલી ડિશોમાં હાજર હોય અને નિયંત્રણ ડિશોમાં ન હોય, વપરાતી સાંદ્રતાઓએ ઔષધશાસ્ત્રીય રીતે સક્રિય હોય, અને પ્રયોગ જે પરિણામ-માપદંડો માપે છે તેમને જ બદલી શકે.

આ ભેદ નીચેની સમગ્ર ચર્ચાનો આધાર છે. ઉછેરમાં નિયમિત ફૂગપ્રતિરોધી ઉપયોગ એક પ્રશ્ન છે. આ ઉમેરણ પદાર્થ તમારી પરીક્ષણ પદ્ધતિ માટે તટસ્થ છે કે નહીં, તે બીજો પ્રશ્ન છે. તાજેતરનું ઝીબ્રાફિશ સંશોધન સાહિત્ય પહેલા પ્રશ્નનો આશ્વાસક જવાબ આપે છે અને બીજાનો અસ્વસ્થ કરનારો.

માર્ગદર્શિકાઓ ખરેખર શું સૂચવે છે

કોઈ એક સર્વમાન્ય ધોરણ નથી, અને આ પણ સમસ્યાનો એક ભાગ છે. Canadian Council on Animal Careની માર્ગદર્શિકા ફૂગની વૃદ્ધિ ઘટાડવા માટે ઈંડાં અને લાર્વાના પરિવહન દ્રાવણમાં 0.5 mg/L, એટલે કે 0.00005%, વાપરવાની મંજૂરી આપે છે. પ્રયોગશાળાનાં પ્રાણીઓ માટેની યુરોપીયન માર્ગદર્શિકા ભ્રૂણોને એવા માધ્યમમાં રાખવાનું વર્ણવે છે જેમાં ઘણી વાર એ જ 0.00005% હોય છે. Cold Spring Harborની E3 બનાવટવિધિમાં ઘટક તરીકે તેના બમણા પ્રમાણ, 1 mg/L એટલે કે 0.0001%,નો ઉલ્લેખ છે. તેની સામે એક નોંધપાત્ર ગેરહાજરી છે: OECDની માછલીના ભ્રૂણ માટેની વિષાક્તતા પરીક્ષણ માર્ગદર્શિકા પુનઃતૈયાર કરેલું પાતળું કરવા માટેનું પાણી અને પરીક્ષણનું રસાયણ નિર્દિષ્ટ કરે છે, પરંતુ તેના 2013ના સંસ્કરણમાં કે પછીના સુધારેલા સંસ્કરણમાં મિથિલીન બ્લૂની કોઈ ભલામણ નથી. એટલે એક પ્રયોગશાળા ઝીબ્રાફિશના ભ્રૂણોને જીવનના પ્રથમ કલાકોથી મિથિલીન બ્લૂવાળા વાદળી પાણીમાં ઉછેરે છે, બીજી નિયમનકારી ભ્રૂણ પરીક્ષણ પારદર્શક પાણીમાં કરે છે, અને બંને પોતપોતાના માધ્યમને સામાન્ય કહે છે. જુદી જુદી પ્રયોગશાળાઓનાં પરિણામોની સરખામણી કરનાર અથવા અગાઉનાં નિયંત્રણ જૂથોના ડેટાને એકત્ર કરનારને આ અસંગતતા વારસામાં મળે છે.

સાંદ્રતાઓનો સંદર્ભ સમજવા માટે, 0.00005% લગભગ 1.56 micromolar છે અને 0.0001% લગભગ 3.13 micromolar છે. આ નાની સંખ્યાઓ છે, અને તેમને અસર કરવા માટે બહુ ઓછી માની લેવાનું સહેલું છે. નીચેના અભ્યાસો બરાબર આ જ ધારણાની, બરાબર આ જ સાંદ્રતાઓએ ચકાસણી કરે છે.

પ્રયોગશાળાને બદલે માછલીપાલનની પૃષ્ઠભૂમિમાંથી આવતા વાચકો આ જ અણુને જુદા સંદર્ભમાં મળે છે, જેની ચર્ચા મિથિલીન બ્લૂ માટેની એક્વેરિયમ માર્ગદર્શિકામાં છે. રસાયણશાસ્ત્ર એકસરખું છે; આ રંગદ્રવ્ય કોષોમાં ઇલેક્ટ્રોનનું વહન કેવી રીતે કરે છે તેની ચર્ચા સમજાવે છે કે રેડોક્સ-સક્રિય સંયોજન ચયાપચયના સંશોધન લેખોમાં વારંવાર શા માટે દેખાય છે. આગળની ચર્ચા ખાસ કરીને મિથિલીન બ્લૂ ધરાવતા ઝીબ્રાફિશનાં ઈંડાંના પાણી વિશે છે.

ચયાપચય: તબક્કા પ્રમાણે અસરની દિશા બદલાય છે

સૌથી વધુ માહિતી આપતા અભ્યાસમાં સામાન્ય રીતે વિકસતી ઝીબ્રાફિશને જીવનના પ્રથમ દિવસથી નિષેચન પછીના 5 દિવસ સુધી રંગદ્રવ્યના સંપર્કમાં રાખવામાં આવી અને દરેક તબક્કે ઓક્સિડેટિવ ચયાપચય માપવામાં આવ્યો, જેમ ભ્રૂણના ચયાપચયના પ્રયોગોનો પ્રકાશિત અહેવાલ વર્ણવે છે. આ પેટર્ન સાવધાનીથી રજૂ કરવો જરૂરી છે, કારણ કે તેની દિશા ઊલટાય છે.

નિષેચન પછીના 1 દિવસે, સંપર્કમાં આવેલા ભ્રૂણોમાં ઉછેર માટેની બંને સાંદ્રતાઓએ મૂળભૂત ઓક્સિજન વપરાશ વધ્યો. 2 દિવસે, 0.00005%, 0.0001% અને 0.0003%ના સંપર્કમાં લાર્વાના સપાટીના સ્તરમાં માઇટોકોન્ડ્રિયાની પટલ વિભવશક્તિ વધી હતી. 4 થી 5 દિવસે, ઈંડાંમાંથી બહાર નીકળ્યા પછી, અસરની દિશા ઊલટાઈ ગઈ હતી: ઓક્સિડેટિવ ઊર્જા ખર્ચ ઘટ્યો, ભલે સંપર્ક નિષેચનથી સતત રહ્યો હોય કે માત્ર દિવસ 3 થી દિવસ 4 સુધીનો ટૂંકા ગાળાનો રહ્યો હોય. સાથે સાથે, માઇટોકોન્ડ્રિયાના શ્વસન સંકુલના ઉપએકમો માટેના ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ 1 અને 4 બંને દિવસે ઘટ્યા, અને સ્ટેરોઇડ નિર્માણ તથા ગ્લુકોનિયોજેનેસિસ સાથે સંકળાયેલા ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ પણ ઘટ્યા.

બીજાં બે અવલોકનો આ ચિત્રને વધુ સ્પષ્ટ કરે છે. ઉછેર માટેની ઊંચી સાંદ્રતાએ ઈંડાંમાંથી બહાર નીકળવાની પ્રક્રિયા થોડી વહેલી થઈ: સંપર્કમાં આવેલા ભ્રૂણો 2 દિવસે આગળ હતા અને નિયંત્રણ જૂથ દિવસ 3 સુધીમાં તેમની બરાબરીએ પહોંચી ગયું. વળી, તાણ-પ્રતિભાવ અક્ષ પોતે અખંડિત જણાયો: જ્યારે 5 દિવસના લાર્વાને ઘૂમરાવવાના તાણકારક પરિબળને આધીન કરવામાં આવ્યા, ત્યારે બંને જૂથોમાં આખા શરીરનું કોર્ટિસોલ સામાન્ય રીતે વધ્યું. એટલે આ પ્રમાણોએ રંગદ્રવ્ય વિકાસ માટેનું સર્વસામાન્ય ઝેર નથી, અને તે દરેક શારીરિક પ્રતિભાવને દબાવી દેતું નથી. તે તબક્કા પ્રમાણે ઊર્જા ચયાપચય બદલે છે—ઈંડાંમાંથી બહાર નીકળતાં પહેલાં વધારે છે અને પછી ઘટાડે છે.

વર્તન: બે અભ્યાસો શા માટે અસહમત છે, અને બંને સાચા કેવી રીતે હોઈ શકે

સંપર્કની રચનાઓને બાજુબાજુ મૂકવામાં ન આવે ત્યાં સુધી વર્તન અંગેનું સંશોધન સાહિત્ય વિરોધાભાસી લાગે છે. એક વિકાસ અને વર્તનની સલામતી અંગેના અભ્યાસમાં નિષેચન પછી લગભગ 6 કલાકથી ભ્રૂણોને 10 micromolar સુધીની સાંદ્રતાઓના સંપર્કમાં રાખવામાં આવ્યા, દિવસ 4 સુધી દ્રાવણો દરરોજ બદલવામાં આવ્યાં, પછી દિવસ 5 અને 6 માટે લાર્વાને રંગદ્રવ્ય વિનાના માધ્યમમાં ખસેડવામાં આવ્યા અને દિવસ 6 પર પ્રકાશ-અંધકાર પરીક્ષણમાં ગતિનું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું. પરિણામ: મૃત્યુદર, ઈંડાંમાંથી બહાર નીકળવાની પ્રક્રિયા કે આકારલક્ષી લક્ષણો પર કોઈ નોંધપાત્ર અસર નહોતી, અને ગતિ પર પણ ઉપચારની કોઈ અસર નહોતી. લેખકોએ તેમની પરિસ્થિતિઓમાં 10 micromolarને ઉપલી મર્યાદા તરીકે ભલામણ કરવી યોગ્ય માની.

બીજા જૂથે, જેના કેટલાક લેખકો ચયાપચયના અભ્યાસના લેખકો પણ હતા, ઉછેરમાં ખરેખર જે રીતે થાય છે તે રીતે સંપર્ક કરાવ્યો: નિષેચન પછીના 2 થી 3 કલાકથી રંગદ્રવ્ય હાજર હતું, દરરોજ દ્રાવણનો થોડો ભાગ બદલાતો હતો, અને સંપર્ક ચાલુ હતો ત્યારે અથવા તાજેતરમાં જ પૂરો થયો હોય ત્યારે વર્તન માપવામાં આવ્યું. એ જ નિયમિત સાંદ્રતાઓએ, લાર્વામાં 24-કલાકના પરીક્ષણમાં ગતિ ઘટેલી જોવા મળી; જુદી જુદી વંશરેખાઓ અને પ્રયોગશાળાઓમાં આ પરિણામ ફરી મળી શક્યું. વર્તનનાં પરિણામોને ગૂંચવતી અસર અંગેના અભ્યાસએ અસરનો સંબંધ સેરોટોનિન-આધારિત પ્રવૃત્તિના સ્તર સાથે દર્શાવ્યો, જે રંગદ્રવ્ય દ્વારા મોનોઅમીન ઓક્સિડેઝના જાણીતા અવરોધ સાથે સુસંગત છે. સૌથી મહત્ત્વની વાત એ હતી કે મિથિલીન બ્લૂ ધરાવતા ભ્રૂણ માધ્યમે SSRI ફ્લુઓક્સેટિન પ્રત્યેનો અપેક્ષિત ગતિ-પ્રતિભાવ ઢાંકી દીધો. તેથી વાદળી પાણીમાં કરેલું સ્ક્રીનિંગ પરીક્ષણ એવી દવાની અસર ચૂકી શકે છે જે પારદર્શક પાણીમાં દેખાઈ હોત.

અહીં ખરેખર કોઈ વિરોધાભાસ નથી. એક પરીક્ષણમાં સંયોજનને ધોઈને દૂર કર્યાના બે દિવસ પછી તેની અસરનો કોઈ શોધી શકાય એવો અવશેષ ન રહી શકે, અને છતાં બીજા પરીક્ષણમાં હાજર હોય ત્યારે તે સક્રિય હોઈ શકે. વ્યવહારુ અર્થ એ છે કે અસર ન દર્શાવતું પરિણામ સાંદ્રતાની ઉપલી મર્યાદાને ટેકો આપે છે, તટસ્થ હોવાના દાવાને નહીં. જ્યારે અસર દર્શાવતું પરિણામ મહત્ત્વના જોખમનું વર્ણન કરે છે: માપનના સમયગાળા દરમિયાન સક્રિય સંપર્ક, એ જ ગોઠવણીમાં જેનો મોટાભાગની પ્રયોગશાળાઓ ઉપયોગ કરે છે.

રેડોક્સ પરીક્ષણની અંદર એક રેડોક્સ રંગદ્રવ્ય

બીજા એક ફંદા માટે અલગ ફકરો જરૂરી છે, કારણ કે તે પ્રાણીને નહીં પરંતુ માપન સાધનને અસરગ્રસ્ત કરે છે. Alamar Blueનું ઊર્જા ખર્ચ પરીક્ષણ પોતે રેડોક્સ રસાયણશાસ્ત્ર પર આધારિત છે: રેસાઝ્યુરિનનું અપચય થઈને ફ્લોરેસન્સ આપતું રેસોરુફિન બને છે. મિથિલીન બ્લૂ પણ રેડોક્સ રસાયણશાસ્ત્ર સાથે સંકળાયેલું છે. કોષ-વિહીન નિયંત્રણોમાં, ઉછેર માટેની બંને સાંદ્રતાઓએ 24 કલાક પછી Alamar Blueનું ફ્લોરેસન્સ થોડું, પરંતુ નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડ્યું. પ્રાણીઓ પરના પ્રયોગોમાં, સંપર્કમાં આવેલા ભ્રૂણોને પરીક્ષણ પહેલાં રંગદ્રવ્ય વિનાના માધ્યમમાં ઓછામાં ઓછા ત્રણ વાર ધોવામાં આવ્યા હતા, અને ઈંડાંમાંથી બહાર નીકળેલા લાર્વામાં જૈવિક અસર કોષ-વિહીન હસ્તક્ષેપ કરતાં વધારે હતી. તેથી બંને બાબતો સાચી છે: ધોયેલા પ્રાણીઓમાં વાસ્તવિક ચયાપચય અસર રહે છે, અને ધોઈને દૂર ન કરેલું રંગદ્રવ્ય તેની ઉપર સીધી રાસાયણિક કૃત્રિમ અસર ઉમેરે છે. નિયંત્રણોએ આ બંનેને અલગ પાડવાં જરૂરી છે, નહીં તો કોઈ પણ આંકડાનો અર્થ રહેતો નથી. રંગદ્રવ્ય-આધારિત પરીક્ષણનાં પરિણામો સમજવા અંગેનું સામાન્ય માર્ગદર્શન અહીં વિશેષ મહત્ત્વ ધરાવે છે.

વિકાસના તબક્કાઓની સમયરેખા

આ લેખ માટેની મૂળ સામગ્રી. જ્યાં અલગથી નોંધ્યું ન હોય ત્યાં સાંદ્રતાઓ ઉછેર માટેનાં બે પ્રમાણભૂત મૂલ્યો, 0.00005% અને 0.0001%, છે.

યાદ રાખવા જેવો પેટર્ન છે: ચયાપચયના પરિણામ-માપદંડોમાં શરૂઆતમાં વધારો અને પછી ઘટાડો, જ્યારે વર્તન પરની અસરો સંપર્ક દરમિયાન હાજર હોય છે અને તેને દૂર કર્યા પછી, આ બાબતનું પરીક્ષણ કરનાર એક પરીક્ષણમાં, શોધી શકાતી નથી.

નિયંત્રણ જૂથોની રચના માટેની ચકાસણી યાદી

બીજી મૂળ સામગ્રી. મિથિલીન બ્લૂવાળી ઝીબ્રાફિશની કાર્યપદ્ધતિઓ પ્રયોગ સાથે જોડાય ત્યારે તેનો ઉપયોગ કરો.

1. રંગદ્રવ્યને પાણી તરીકે નહીં, પરંતુ અભિકર્મક તરીકે નોંધો. સાંદ્રતા ટકા અને micromolar બંનેમાં જણાવો, સંપર્કની શરૂઆત અને અંત નિષેચન પછીના કલાકો અથવા દિવસોમાં જણાવો, દ્રાવણ બદલવાનું સમયપત્રક આપો અને દરેક માપન પહેલાં ધોઈને દૂર કરવા માટેનો સમયગાળો જણાવો.
2. નિયંત્રણોને પ્રશ્ન અનુસાર ગોઠવો. પરીક્ષણના રસાયણના અભ્યાસ માટે રંગદ્રવ્ય વિનાનાં નિયંત્રણો જરૂરી છે; ઉછેરના અભ્યાસ માટે રંગદ્રવ્ય વિનાનાં અને રંગદ્રવ્યવાળાં જૂથોની સરખામણી જરૂરી છે, જેમાં ફૂગપ્રતિરોધી પરિણામ નોંધાયેલું હોય, કારણ કે ટાંકવામાં આવેલા બંને અભ્યાસોમાંથી કોઈએ ફૂગપ્રતિરોધી અસરકારકતા માપી નહોતી.
3. રેડોક્સ પરીક્ષણો પહેલાં ધોવો, પછી ખરાઈ કરો. રંગદ્રવ્ય વિનાના માધ્યમમાં ઓછામાં ઓછા ત્રણ વાર ધોવો અને સાથે રંગદ્રવ્ય તથા અભિકર્મક ધરાવતું કોષ-વિહીન નિયંત્રણ ચલાવો, કારણ કે રંગદ્રવ્ય Alamar Blueના સંકેતને સીધો ઘટાડે છે.
4. વર્તન અને મોનોઅમીનના પરિણામ-માપદંડોને ઊંચા જોખમવાળા માનો. ગતિ, ચમકીને આપેલો પ્રતિભાવ, ચિંતા જેવું વર્તન, એન્ટીડિપ્રેસન્ટ અને MAO-અવરોધકના અભ્યાસોએ માપન દરમિયાન રંગદ્રવ્ય ટાળવું જોઈએ અથવા ચોક્કસ પરિણામ-માપદંડ માટે તેની તટસ્થતા દર્શાવવી જોઈએ; એકથી બે દિવસ ધોઈને દૂર કરવાથી ગતિ પરની એક અસર દૂર થઈ હતી, પરંતુ અન્ય પ્રાયોગિક ગોઠવણો માટે તે સાબિત થયું નથી.
5. દરેક તબક્કે ચયાપચય અને માઇટોકોન્ડ્રિયાના પરિણામ-માપદંડોને ઊંચા જોખમવાળા માનો. ઓક્સિજન વપરાશ, ઊર્જા ખર્ચ, પટલ વિભવશક્તિ અને શ્વસન શૃંખલાના ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ ઉછેર માટેની સાંદ્રતાઓએ બદલાય છે, અને ઈંડાંમાંથી બહાર નીકળતાં પહેલાં અને પછી વિરુદ્ધ દિશામાં બદલાય છે.
6. એક પ્રાયોગિક રચનાની તટસ્થતા બીજી પર લાગુ ન કરો. ધોઈને દૂર કર્યા પછી અસર ન દર્શાવતું પરિણામ ચાલુ સંપર્કને લાગુ પડતું નથી; આકારલક્ષી લક્ષણોમાં અસર ન દર્શાવતું પરિણામ ચયાપચય કે દવા સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને લાગુ પડતું નથી; એક વંશરેખા, તાપમાન કે પરીક્ષણની અવધિનું પરિણામ અન્યને લાગુ પડતું નથી.
7. તમે અનુસરેલી માર્ગદર્શિકા અને તેનો વિકલ્પ જણાવો. CCAC, યુરોપીયન અથવા Cold Spring Harborની સાંદ્રતાઓ સ્પષ્ટ રીતે જણાવો, અને OECDના ભ્રૂણ પરીક્ષણમાં રંગદ્રવ્યનો સમાવેશ ક્યાં નથી તે નોંધો, જેથી વાચક તમારા પ્રાણીઓ કઈ પરિસ્થિતિમાં રાખવામાં આવ્યાં હતાં તે સમજી શકે.

આમાંથી કોઈ વાત ઈંડાંને જીવંત રાખવા માટે રંગદ્રવ્યના ઉપયોગની વિરુદ્ધ નથી. વાત એ છે કે ઉછેરની પસંદગીને તપાસ્યા વિના ડેટામાં સામેલ થવા ન દેવી. ડિશમાં રહેલો વાદળી રંગ ઔષધશાસ્ત્રીય ગુણધર્મો ધરાવતો અણુ છે, અને જે પ્રયોગોનાં પરિણામો વિકૃત થવાની સૌથી વધુ શક્યતા છે તે ચોક્કસ એ જ મોટા પાયે ઝડપી ચયાપચય અને ચેતાતંત્ર-સંબંધિત વર્તનનાં સ્ક્રીનિંગ છે, જેના માટે હવે નાની વયની ઝીબ્રાફિશને પ્રાધાન્ય આપવામાં આવે છે. તેની નોંધ કરો, તેનું નિયંત્રણ રાખો, માપતાં પહેલાં તેને ધોઈને દૂર કરો અને તે ચૂપચાપ ભાગ લઈ રહ્યું હોઈ શકે એવા પરીક્ષણની ચકાસણી કરો.