મેથિલીન બ્લુથી યીસ્ટનાં પરીક્ષણો: જીવંત કોષોની ગણતરી સામે શ્વસનનો સમય માપવો

પ્રયોગશાળાના મેજ પર બે નળીઓ છે. બંને વાદળી છે. એકમાં, માઇક્રોસ્કોપ હેઠળ દેખાતા વાદળી કોષોનો અર્થ મૃત યીસ્ટ છે. બીજીમાં, નળીનો રંગ વાદળીમાંથી રંગહીન થાય તેનો અર્થ યીસ્ટ જીવંત છે અને શ્વસન કરે છે. રંગદ્રવ્ય એક જ, પણ અર્થઘટન વિરુદ્ધ. આ બે પરીક્ષણોને ગૂંચવો તો દરેક નિષ્કર્ષ ઊલટાઈ જાય.

આ ભેદ જ આખા લેખનો વિષય છે. મેથિલીન બ્લુ એક રેડોક્સ રંગદ્રવ્ય છે: ઓક્સીકૃત અવસ્થામાં તે વાદળી હોય છે, અને અપચયિત અવસ્થામાં તે રંગહીન લ્યુકોમેથિલીન બ્લુ હોય છે. જીવંતતાની ગણતરી આ રસાયણશાસ્ત્રનો ઉપયોગ માઇક્રોસ્કોપ હેઠળના ટૂંકા અવલોકનમાં કરે છે. શ્વસનનો પ્રયોગ તેનો ઉપયોગ સમગ્ર મિશ્રણની સમયબદ્ધ પ્રતિક્રિયામાં કરે છે. દરેકને પોતાની પદ્ધતિ, પોતાનાં નિયંત્રણો અને પોતાની મર્યાદાઓ અંગે સાવચેતી જોઈએ.

જીવંતતાની ગણતરી: ટૂંકું રંગન, તરત અવલોકન

બ્રૂઅરીમાં વપરાતી પદ્ધતિ સૌથી વધુ પ્રમાણિત આવૃત્તિ છે. 2% સોડિયમ સાઇટ્રેટમાં 0.01% w/v મેથિલીન બ્લુ તૈયાર કરો, તેને યીસ્ટના સસ્પેન્શન સાથે 1:1 પ્રમાણમાં મિશ્રિત કરો અને ટૂંકા નિશ્ચિત સમયગાળા પછી મિશ્રણ તપાસો. પ્રકાશિત સમયગાળા Brewing Science Instituteની માર્ગદર્શિકામાં 1 થી 2 મિનિટથી લઈને સંશોધન પદ્ધતિઓમાં લગભગ 5 મિનિટ સુધી બદલાય છે, જ્યારે OIVની વાઇન માઇક્રોબાયોલોજી પદ્ધતિ મુજબ 10 મિનિટની અંદર તપાસ જરૂરી છે. ગણતરી માટેના મિશ્રણમાં રંગદ્રવ્યની અંતિમ સાંદ્રતા લગભગ 0.005% થાય છે. સુધારેલી Neubauer ચેમ્બરમાં મિશ્રણ ભરો અને લગભગ 400x પર ઘેરા વાદળી કોષોને અજીવંત તથા રંગ ન લાગેલા કોષોને જીવંત તરીકે વર્ગીકૃત કરો. OIV પદ્ધતિમાં આછા વાદળી કોષોને જીવંત ગણવામાં આવે છે, જે નીચે ચર્ચાયેલી વ્યક્તિલક્ષી નિર્ણયની સમસ્યાનો સંકેત આપે છે.

કોષોની સાંદ્રતા ચેમ્બરની ભૂમિતિ પરથી મળે છે. જ્યારે કેન્દ્રનો આખો 1 mm ચોરસ ગણવામાં આવે, ત્યારે પ્રતિ mL કોષોની સંખ્યા N ગુણ્યા મંદન ગુણાંક ગુણ્યા 10^4 થાય છે, જ્યાં N એ તે વિસ્તારની ગણતરી છે, જેમ ASBCની યીસ્ટ પદ્ધતિઓમાં દર્શાવ્યું છે. જીવંતતાની ગણતરી વધુ સરળ છે: રંગ ન લાગેલા કોષોને કુલ કોષોથી ભાગો અને 100થી ગુણો. FEMSના બ્રૂઅરી તુલનાત્મક અભ્યાસ અને OIVની પ્રથા પ્રમાણે, જીવંતતાનો અંદાજ મેળવવા લગભગ 400 કોષો ગણો. સીમારેખાનો એક જ નિયમ સતત લાગુ કરો, ઉદાહરણ તરીકે નીચેની અને ડાબી જાળીરેખા પરના કોષો ગણો અને ઉપરની તથા જમણી જાળીરેખા પરના કોષો ન ગણો.

ગણતરી શરૂ થાય તે પહેલાં કલિકાઓ માટે નિયમ નક્કી કરવો જરૂરી છે. સામાન્ય પ્રથા મુજબ, કલિકા માતૃકોષના લગભગ અડધા કદ સુધી પહોંચે ત્યારે તેને અલગ કોષ ગણવામાં આવે છે; તેનાથી નાની હોય તો માતૃકોષ સાથે ગણવામાં આવે છે. જે નિયમ પસંદ કરો તે દરેક ચોરસમાં લાગુ કરો અને કાર્યપત્રિકા પર લખો, જેથી પછીની વ્યક્તિ પણ એ જ રીતે ગણતરી કરે.

ગણતરીની કાર્યપત્રિકા (આ છાપો)

આ કાર્યપત્રિકા આ લેખ માટે તૈયાર કરેલી મૂળ સામગ્રી છે. તેને નોટબુકમાં ઉતારો અથવા દરેક નમૂના માટે એક નકલ છાપો.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, જેમાં N નિર્ધારિત ચેમ્બર વિસ્તારમાંથી મળે છે. પરિણામની બાજુમાં રંગનનો સમયગાળો નોંધો, કારણ કે સમયની નોંધ વિના જીવંતતાનો આંકડો પુનરુત્પાદિત કરી શકાતો નથી.

જીવંતતાના આંકડા કેમ બદલાય છે

સમય પ્રથમ દખલ છે, અને તે બંને દિશામાં અસર કરે છે. ચયાપચયની દૃષ્ટિએ સક્રિય કોષો રંગદ્રવ્યનું અપચય કરે છે, તેથી વહેલું અવલોકન જીવંત કોષોએ અપચય પૂર્ણ કર્યો હોય તે પહેલાં થઈ શકે છે અને તેમને ખોટી રીતે મૃત ગણાવી શકે છે. પરંતુ લાંબા સમય સુધી રંગદ્રવ્યના સંપર્કમાં રહેવું પોતે ઝેરી અસર કરે છે અને ખરેખર નુકસાન પામેલા વાદળી કોષો બનાવે છે, જેથી મૃત કોષો હોવાનું ભ્રામક રંગન મળે છે. તેથી પ્રયોગશાળાની એક શિક્ષણ પદ્ધતિમાં 5 મિનિટની અંદર મૂલ્યાંકન કરવાનું જણાવાયું છે, જે વિસ્કોન્સિનની યીસ્ટ શિક્ષણ પદ્ધતિમાં નોંધાયેલું છે. સાવચેતીપૂર્વકનો નિષ્કર્ષ એ છે કે મેથિલીન બ્લુથી મૂલ્યાંકન સમય પર આધારિત છે, તેથી એક ટૂંકો સમયગાળો નક્કી કરો અને શ્રેણીના દરેક નમૂનામાં તેને એકસરખો રાખો.

ઓછી જીવંતતા ધરાવતા નમૂનાઓમાં બીજો પૂર્વગ્રહ જોવા મળે છે. પ્રમાણિત પદ્ધતિ ચેતવે છે કે લગભગ 80%થી નીચે મેથિલીન બ્લુ સાચી જીવંતતાનો વધુ પડતો અંદાજ આપી શકે છે, કારણ કે જે કોષો હજી રંગદ્રવ્યનું અપચય કરે છે તેઓ પ્રજનનક્ષમતા જાળવી રાખે જ એવું નથી. બ્રૂઇંગ સાહિત્યમાં પણ જીવંતતા નોંધપાત્ર રીતે ઘટી હોય ત્યારે આવી જ અવિશ્વસનીયતા વર્ણવાય છે. મેથિલીન બ્લુને ઝડપી, અંદાજિત માપ તરીકે લો અને ઓછી જીવંતતા અંગેના મહત્વપૂર્ણ નિર્ણયો, જેમ કે કલ્ચરનો ફરી આથવણ માટે ઉપયોગ કરવો, પ્લેટ પરની ગણતરી અથવા પૂરક રંગનથી ખાતરી કરીને લો.

નમૂનાના માધ્યમની અસરો ત્રીજા ક્રમે આવે છે. OIV પદ્ધતિ લગભગ pH 4.6 પર ચાલે છે અને ચેતવે છે કે પ્રબળ બફરવાળા નીચા pHના નમૂનાઓ રંગદ્રવ્યને યોગ્ય રીતે વર્તવા દેતા નથી. તે 100 g/Lથી વધુ ખાંડ હોય ત્યારે આ પરીક્ષણ ન કરવાની પણ સલાહ આપે છે, કારણ કે ત્યાં કોષો ભ્રામક રીતે આછા વાદળી દેખાય છે. રંગનના pHની પ્રાયોગિક તુલનામાં તપાસેલી શ્રેણીમાં સંવેદનશીલતા નોંધપાત્ર રીતે બદલાતી જોવા મળી, જે pH પર આધારિત મેથિલીન બ્લુ પદ્ધતિના અભ્યાસ સાથે સુસંગત છે. કચરો એક અલગ ફંદો છે: અશુદ્ધ મેશમાં રંગ લાગેલા કણો મૃત કોષો જેવા દેખાય છે અને જુદા સંચાલકોની ગણતરી વચ્ચેની ભિન્નતા વધારે છે.

આ ભિન્નતા માત્ર અનુભવો પર આધારિત નથી, તે માપવામાં આવી છે. FEMSની યીસ્ટ તુલનામાં જણાવેલા છ મહિનાના બ્રૂઅરી પરીક્ષણમાં, મેથિલીન બ્લુના બે વાર કરેલા માપનો સરેરાશ પ્રમાણભૂત વિચલન 6.1% હતો, જ્યારે ઓક્સોનોલ ફ્લો સાયટોમેટ્રી માટે તે 0.2% હતો; એક જ નમૂનામાં બે સંચાલકોના પરિણામો વચ્ચે 13 ટકા પોઇન્ટ સુધીનો તફાવત હતો. જીવંતતા માપવાની પદ્ધતિઓની 2023ની પરિમાણાત્મક તુલનામાં ફ્લોરેસન્સ માઇક્રોસ્કોપી અને ફ્લો સાયટોમેટ્રી નોંધપાત્ર રીતે વધુ ચોકસાઈ ધરાવતી જણાઈ, સાથે એ પણ દર્શાવાયું કે કામગીરી પ્રજાતિ અને નમૂનાના માધ્યમ પર આધારિત છે. Painting અને Kirsop (PMID 24430080) દ્વારા કરેલું પરંપરાગત પદ્ધતિનું વર્ણન હજી સંદર્ભબિંદુ છે, અને યીસ્ટની જીવંતતા અને સક્રિયતાનાં પરીક્ષણોની વિસ્તૃત સમીક્ષા (PMID 25154541) મેથિલીન બ્લુને નિર્ણાયક નહીં, પરંતુ પૂરક પરીક્ષણોમાં સ્થાન આપે છે. અહીં ટ્રાયપન બ્લુ આપમેળે વધુ સારો વિકલ્પ નથી: તે કોષપટલની અખંડિતતા ગુમાવાનું દર્શાવે છે, જ્યારે મેથિલીન બ્લુ રંગદ્રવ્યના ગ્રહણ સાથે અપચયની પ્રવૃત્તિ દર્શાવે છે, તેથી તાણગ્રસ્ત કોષોનું આ બે રંગદ્રવ્યો હેઠળ જુદું વર્ગીકરણ થઈ શકે છે.

શ્વસનનો પ્રયોગ: વાદળી રંગ દૂર થવાનો સમય માપો

બીજા પરીક્ષણમાં માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ જ થતો નથી. યીસ્ટ, ગ્લુકોઝ અને મંદ મેથિલીન બ્લુ બંધ નળીમાં મૂકવામાં આવે છે, અને વાદળી રંગ ગાયબ થવામાં કેટલો સમય લાગે છે તે ઘડિયાળથી માપવામાં આવે છે. કોષો ચયાપચય કરે ત્યારે તેઓ અપચાયક સમકક્ષો ઉત્પન્ન કરે છે, જે વાદળી રંગદ્રવ્યને તેના રંગહીન સ્વરૂપમાં ફેરવે છે, જ્યારે દ્રાવિત ઓક્સિજન તેને ફરી ઓક્સીકૃત કરે છે. કોષો ઓક્સિજનનું પ્રમાણ ઘટાડે પછી, ચોખ્ખો અપચય પ્રબળ બને છે અને નળીનો રંગ દૂર થાય છે. તેથી અંતબિંદુ શ્વસન, રંગદ્રવ્યની સાંદ્રતા અને ઓક્સિજનની ઉપલબ્ધતા વચ્ચેનું સંતુલન દર્શાવે છે. તેને મેથિલીન બ્લુના અપચય અથવા રંગ દૂર થવાના સમય તરીકે નોંધવું જોઈએ, આણ્વિક ઓક્સિજનના વપરાશના સીધા દર તરીકે નહીં.

સમય અનુકૂળ શ્રેણીમાં આવે તે માટે જીવંતતાના પરીક્ષણ કરતાં ઘણું વધુ મંદ રંગદ્રવ્ય વાપરો. AQAની A લેવલ જરૂરી પ્રાયોગિક માર્ગદર્શિકા આને સારી રીતે પ્રમાણિત કરે છે: લગભગ 30 C સુધી ગરમ કરેલા દર 100 mL પાણીમાં 1 g ગ્લુકોઝ, ઉપયોગ કરતાં તરત પહેલાં ઉમેરેલું 5 g સૂકું યીસ્ટ અને 1% સ્ટોક દ્રાવણના 0.1 mLને મંદન કરીને 100 mL બનાવવાથી તૈયાર કરેલું લગભગ 0.001% કાર્યકારી રંગદ્રવ્ય. 2 mL યીસ્ટ-ગ્લુકોઝ સસ્પેન્શનને 2 mL કાર્યકારી રંગદ્રવ્ય સાથે મિશ્રિત કરો, પરીક્ષણના તાપમાને સંતુલિત થવા દો, એક વાર 10 સેકન્ડ માટે હલાવો, ટાઇમર શરૂ કરો અને ફરી હલાવશો નહીં. હલાવવાથી ઓક્સિજન ફરી પ્રવેશે છે અને નળી ફરી વાદળી બને છે; આ પ્રક્રિયાથી ઊભી થતી સૌથી મોટી કૃત્રિમ અસર છે. AQA નોંધે છે કે આ તૈયાર મિશ્રણનો રંગ સામાન્ય રીતે 35 C પર લગભગ 5 મિનિટની અંદર દૂર થવો જોઈએ, અને પ્રાયોગિક સરેરાશો 20 C પર 275 s, 35 C પર 128 s અને 45 C પર 145 s છે. આ એક પ્રાયોગિક ગોઠવણનાં ઉદાહરણો છે, સર્વત્ર લાગુ પડતા માપદંડો નહીં. નિયંત્રિત પરિસ્થિતિઓમાં અપચયના દર અને ચયાપચયની દૃષ્ટિએ સક્રિય યીસ્ટ વચ્ચેના પરિમાણાત્મક સંબંધને વિશિષ્ટ અપચય અભ્યાસો સમર્થન આપે છે, જેમાં PMID 25773544 તરીકે સૂચિબદ્ધ કાર્ય અને Yeast (2014)માં પ્રકાશિત ક્રિયાપ્રણાલીનો અભ્યાસ સામેલ છે.

સમયક્રમનું નિદર્શન (મૂળ સામગ્રી)

નીચેનું કોષ્ટક આ લેખ માટે ઉપર વર્ણવેલી AQA શૈલીની ગોઠવણનો ઉપયોગ કરીને તૈયાર કરેલું મૂળ નિદર્શન છે: 2 mL યીસ્ટ-ગ્લુકોઝ મિશ્રણ સાથે લગભગ 0.001%નું 2 mL કાર્યકારી રંગદ્રવ્ય, એક વાર 10 સેકન્ડ હલાવવું અને પછી હલાવ્યા વિના ઇન્ક્યુબેશન. નોંધો એ સ્વરૂપનાં ઉદાહરણરૂપ વાંચન છે જેમાં વિદ્યાર્થીઓના જૂથે નોંધ કરવી જોઈએ; દર સૂચકાંકની વ્યાખ્યા 1ને સેકન્ડમાં માપેલા રંગ દૂર થવાના સમયથી ભાગવાથી મળે છે. આ જ નળીઓ સાથે પ્રયોગ કરો અને આ નોંધોની જગ્યાએ માપેલા મૂલ્યો મૂકો.

A, B અને C નળીઓ માટે તાપમાન સામે દર સૂચકાંકનો આલેખ બનાવો. વક્ર પહેલાં ઊંચો જાય છે અને પછી સપાટ થાય છે અથવા નીચે આવે છે; આ ઉત્સેચકથી ચાલતી અપેક્ષિત રીત છે, સીધી રેખા નહીં. D, E અને F નળીઓ તે વક્ર પરનાં ડેટા બિંદુઓ નથી. તે એવા નિયંત્રણો છે જે વક્રનું અર્થઘટન શક્ય બનાવે છે.

દરેક પરીક્ષણને અર્થપૂર્ણ બનાવતાં નિયંત્રણો

શ્વસનના દરેક પ્રયોગ સાથે ત્રણ સહાયક નળીઓ જરૂરી છે. ઉકાળેલું અથવા નિર્જીવ કરેલું યીસ્ટ, ગ્લુકોઝ અને રંગદ્રવ્યનું મિશ્રણ વાદળી રહેવું જોઈએ, જેથી સાબિત થાય કે ઝડપી અપચય જીવંત ચયાપચય પર આધારિત છે. વધારાનો ગ્લુકોઝ ઉમેર્યા વિના જીવંત યીસ્ટ અને રંગદ્રવ્યનું મિશ્રણ સબસ્ટ્રેટ નિયંત્રણ છે, પરંતુ તેમાં પણ ધીમે રંગ દૂર થવાની અપેક્ષા રાખો, કારણ કે યીસ્ટ પોતાના આંતરિક સંગ્રહનો ઉપયોગ કરે છે. યીસ્ટ વિના ગ્લુકોઝ અને રંગદ્રવ્યનું મિશ્રણ રાસાયણિક બ્લૅન્ક છે; તે આવશ્યક છે, કારણ કે ક્ષારીય ગ્લુકોઝ કોઈ કોષ હાજર ન હોય તોપણ મેથિલીન બ્લુનું અપચય કરી શકે છે.

જીવંતતાની ગણતરીને જુદા પ્રકારનું નિયંત્રણ જોઈએ: પ્રક્રિયામાં એકરૂપતા. એક જ રંગદ્રવ્યનું સ્ટોક દ્રાવણ, એક જ મિશ્રણ પ્રમાણ, એક જ રંગન સમયગાળો, એક જ ચેમ્બર વિસ્તાર, કલિકા અને સીમારેખા માટે એક જ નિયમો અને શક્ય હોય ત્યાં નમૂનાની ઓળખ જાણ્યા વિના ગણતરી. જ્યારે બે સંચાલકોના પરિણામોમાં દસ પોઇન્ટનો તફાવત હોય, ત્યારે કાર્યપત્રિકા સામાન્ય રીતે કારણ બતાવી આપે છે: જુદો સમય, વાદળી ગણવાની જુદી સીમા અથવા કલિકા માટે જુદા નિયમો. રંગેલા કોષો તૈયાર કરવાની અને જોવાની તકનીકો બેક્ટેરિયાના સરળ રંગનની પદ્ધતિઓ સાથે જોડાયેલી છે, જ્યારે જુદા નમૂનાઓમાં રંગદ્રવ્ય શું દર્શાવે છે તેનો વિસ્તૃત સર્વે માઇક્રોસ્કોપી રંગન એટલસમાં છે. વાદળી રંગની કોઈ પણ તીવ્રતાને પરિમાણાત્મક રીતે વાંચવા પાછળના ભૌતિકશાસ્ત્ર માટે, પરિસ્થિતિઓ દર્શાવતો અવશોષણ સંદર્ભ સમજાવે છે કે દરેક ગુણાંક સાથે તેના દ્રાવક, pH અને સાંદ્રતાની પરિસ્થિતિઓ શા માટે આપવી જરૂરી છે.

પ્રશ્ન પ્રમાણે પરીક્ષણ પસંદ કરો. અત્યારે કેટલા કોષો જીવંત છે તે ગણતરીનો પ્રશ્ન છે, જેનો જવાબ માઇક્રોસ્કોપ અને કાર્યપત્રિકા વડે મળે છે. આ કલ્ચર કેટલી સક્રિયતાથી શ્વસન કરે છે તે ગતિકીય પ્રશ્ન છે, જેનો જવાબ સ્ટોપવોચ અને નિયંત્રિત નળીઓ વડે મળે છે. મેથિલીન બ્લુ બંને માટે ઉપયોગી છે, પરંતુ ક્યારેય એક જ નળીમાં એક જ સમયે નહીં.