G6PD પ્રયોગશાળા પરીક્ષણોમાં મેથિલીન બ્લુ: આ રંગદ્રવ્ય ખરેખર શું કરે છે

એક વિદ્યાર્થી ઇન્ક્યુબેશન પછી બે નળીઓ જુએ છે. એકનો રંગ અપેક્ષા મુજબ બદલાયો છે. બીજીનો બદલાયો નથી. વિદ્યાર્થી તારણ કાઢે છે કે બીજા દર્દીમાં ગ્લુકોઝ-6-ફોસ્ફેટ ડિહાઇડ્રોજનેઝની ઊણપ છે. આ તારણ સાચું હોઈ શકે છે, પરંતુ આ તર્કમાં પરીક્ષણને કાર્યરત બનાવતો મૂળ ખ્યાલ ચૂકી જવાય છે. નળીમાં કંઈ પણ એન્ઝાઇમને સીધું માપતું નથી. મેથિલીન બ્લુને મધ્યસ્થી તરીકે વાપરીને, નળી એન્ઝાઇમ જે ઉત્પન્ન કરે છે તેને માપે છે.

આ પરોક્ષ માપન સમજાઈ જાય પછી પ્રક્રિયા, નિયંત્રણ નમૂનાઓ અને ખોટાં પરિણામોની લાંબી યાદી મનસ્વી લાગતાં નથી.

ટૂંકો જવાબ

G6PD પરીક્ષણમાં મેથિલીન બ્લુ રેડોક્સ સૂચક છે. G6PD એન્ઝાઇમ NADPH ઉત્પન્ન કરે છે, અને NADPH પર આધારિત પ્રણાલીઓ વાદળી મેથિલીન બ્લુનું અપચય કરીને તેને રંગહીન લ્યુકો સ્વરૂપમાં ફેરવે છે (અથવા તેનો ઉપયોગ ઇલેક્ટ્રોનના વહન માટે કરે છે). એન્ઝાઇમની સામાન્ય સક્રિયતા કાર્યક્ષમ અપચય આપે છે. ઓછી સક્રિયતા ધીમું અથવા અધૂરું અપચય આપે છે. પરીક્ષણનો આખો સંકેત આ જ છે.

બે ઐતિહાસિક પદ્ધતિઓમાં એક જ રંગદ્રવ્ય વપરાય છે, પરંતુ તેમનાં અંતિમ બિંદુઓ જુદાં છે. તેમને અલગ સમજો તો મોટાભાગની ગૂંચવણ દૂર થાય છે.

બે પરીક્ષણો, એક રંગદ્રવ્ય, જુદાં અંતિમ બિંદુઓ

પહેલું સીધું મેથિલીન બ્લુ અપચય પરીક્ષણ છે, જેનું વર્ણન સાસ અને તેમના સહકર્મીઓએ કર્યું હતું અને પછી ગિબ્સે તેનું મૂલ્યાંકન કર્યું હતું. અહીં અંતિમ બિંદુ રંગદ્રવ્ય પોતે છે: ઓક્સિડિત વાદળી મેથિલીન બ્લુનું અપચય થઈને તે રંગહીન લ્યુકોમેથિલીન બ્લુ તરફ જાય છે, અને આ ફેરફારનો દર NADPH ઉત્પન્ન કરવાની ક્ષમતા દર્શાવે છે. મૂળ સ્ક્રીનિંગ સંશોધનપત્ર PubMed પર સાસ અને સહકર્મીઓ (1966) હેઠળ સૂચિબદ્ધ છે.

બીજું બ્રુઅર મેથેમોગ્લોબિન અપચય પરીક્ષણ છે. સોડિયમ નાઇટ્રાઇટ પહેલાં હિમોગ્લોબિનનું ઓક્સિડેશન કરીને તેને ભૂરા મેથેમોગ્લોબિનમાં ફેરવે છે. ત્યારબાદ મેથિલીન બ્લુ ઇલેક્ટ્રોન-સ્થાનાંતરણના મધ્યસ્થી તરીકે કામ કરે છે: અપચયિત મેથિલીન બ્લુ મેથેમોગ્લોબિનને અપચાયક સમતુલ્યો આપે છે અને તેને ફરી લાલ હિમોગ્લોબિનમાં ફેરવે છે. તેથી દૃશ્ય અંતિમ બિંદુ ભૂરો સામે લાલ છે, વાદળી સામે રંગહીન નહીં. મૂળ પદ્ધતિ વિશ્વ આરોગ્ય સંસ્થાના બુલેટિનમાં (બ્રુઅર અને સહકર્મીઓ, 1960) પ્રકાશિત થઈ હતી.

બ્રુઅર પરીક્ષણને રંગદ્રવ્યના રંગ દૂર થવાનું પરીક્ષણ કહેવું રાસાયણિક દૃષ્ટિએ ચોક્કસ નથી. રંગદ્રવ્ય ચક્રમાં કાર્ય કરે છે; હિમોગ્લોબિનનો રંગ બદલાય છે. નીચેનો આલેખ બંને માર્ગો દર્શાવે છે.

મૂળભૂત પ્રતિક્રિયા

G6PD પેન્ટોઝ ફોસ્ફેટ માર્ગના પ્રથમ ઓક્સિડેટિવ પગલાનું ઉત્પ્રેરણ કરે છે:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

પરિપક્વ લાલ રક્તકોશો NADPH માટે આ માર્ગ પર ખૂબ આધાર રાખે છે, જેમ કે લુઝાટ્ટો અને સહકર્મીઓએ Bloodમાં કરેલી સમીક્ષા (2020)માં સમજાવ્યું છે. NADPH ગ્લુટાથાયોનને અપચયિત અવસ્થામાં રાખે છે અને કોષને ઓક્સિડેટિવ નુકસાનથી બચાવે છે. મેથિલીન બ્લુ ઇલેક્ટ્રોન સ્વીકારક તરીકે આ વ્યવસ્થામાં જોડાય છે. પૂરતું G6PD પૂરતું NADPH આપે છે, જે કાર્યક્ષમ અપચય આપે છે. ઓછું G6PD આ સાંકળને તેની પહેલી જ કડી પર તોડે છે.

રંગદ્રવ્યને એન્જિન નહીં, પરંતુ ઇંધણનું માપક સમજો. તે NADPHના પુરવઠાનો સંકેત આપે છે. આ પુરવઠા અથવા પરિણામના વાંચનને બદલતું બીજું કંઈ પણ જનીનમાં કોઈ ફેરફાર વિના માપકની સોય ખસેડી શકે છે.

બ્રુઅર પ્રકારની પ્રક્રિયા કેવી રીતે થાય છે

દાયકાઓ દરમિયાન અભિકર્મકોની બનાવટ બદલાતી રહી છે, તેથી શૈક્ષણિક વર્ણનને ક્લિનિકલ પ્રોટોકોલ સમજવું નહીં. દરેક પ્રયોગશાળા પોતાની માન્ય કરેલી પ્રમાણભૂત કાર્યપદ્ધતિ અનુસરે છે. આ સાવચેતી સાથે, પરંપરાગત નળી-આધારિત ગોઠવણ નીચે મુજબ કામ કરે છે; આ પ્રકાશિત અમલીકરણમાં તેનું વર્ણન ત્રણ નળીઓ અને 3-કલાકના ઇન્ક્યુબેશન સાથે કરવામાં આવ્યું છે:

1. દર્દીની નળી: સંપૂર્ણ રક્ત સાથે ગ્લુકોઝ, સોડિયમ નાઇટ્રાઇટ અને મેથિલીન બ્લુ. નાઇટ્રાઇટ મેથેમોગ્લોબિન બનાવે છે, ગ્લુકોઝ લાલ રક્તકોશોના ચયાપચયને ઇંધણ પૂરું પાડે છે, અને રંગદ્રવ્ય NADPH પર આધારિત વહનનું કામ કરે છે.
2. ઓક્સિડિત નિયંત્રણ: રક્ત સાથે નાઇટ્રાઇટ અને ગ્લુકોઝ, પરંતુ મેથિલીન બ્લુ વિના. તે ભૂરા મેથેમોગ્લોબિનનું અંતિમ બિંદુ દર્શાવે છે, જે ઊણપનો નમૂનો છે.
3. હિમોગ્લોબિન નિયંત્રણ: રક્ત સાથે પાણી. તે લાલ હિમોગ્લોબિનનું અંતિમ બિંદુ દર્શાવે છે, જે સામાન્ય નમૂનો છે.
4. બધી નળીઓને હળવેથી મિશ્રિત કરતાં, લગભગ 37 C પર, સામાન્ય રીતે 3 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો.
5. દરેક નળીના નાનાં અંશને નિસ્યંદિત પાણીમાં પાતળો કરો, જેથી કોષો તૂટે અને રંગની સરખામણી સ્પષ્ટ રીતે કરી શકાય.
6. દર્દીની નળીની બંને નિયંત્રણો સાથે સરખામણી કરો. ફરી લાલ તરફ વળવું નોંધપાત્ર અપચાયક ક્ષમતા દર્શાવે છે. ભૂરો રંગ જળવાઈ રહેવો નોંધપાત્ર ઊણપ સૂચવે છે.

એક ઐતિહાસિક બનાવટમાં લગભગ 1 mL રક્ત સાથે આશરે 180 mM સોડિયમ નાઇટ્રાઇટ, 280 mM ડેક્સ્ટ્રોઝ અને 0.4 mM મેથિલીન બ્લુ ધરાવતા અભિકર્મકો વપરાતા હતા. આ આંકડાઓને સાહિત્યમાંથી લીધેલા ઉદાહરણ તરીકે જુઓ, સર્વત્ર લાગુ પડતા નિર્દેશ તરીકે નહીં.

પરિણામનું અર્થઘટન

ગુણાત્મક સ્ક્રીનિંગ સામાન્ય સક્રિયતાના લગભગ 30 થી 40 ટકા આસપાસ સૌથી સારી રીતે ભેદ પારખે છે, જેમ કે G6PD શોધમાં રહેલી ખામીઓ અંગેની આ Malaria Journal સમીક્ષામાં ચર્ચા કરવામાં આવી છે. તેથી સામાન્ય સ્ક્રીનિંગ પરિણામનો અર્થ એ છે કે પરીક્ષણમાં ગંભીર ઊણપ મળી નથી. તે સક્રિયતા સંપૂર્ણપણે સામાન્ય હોવાનું પ્રમાણિત કરતું નથી.

સ્ક્રીનિંગ શા માટે ગેરમાર્ગે દોરી શકે છે

હિમોલિસિસ પછી રેટિક્યુલોસાઇટોની સંખ્યામાં વધારો ખોટું સામાન્ય પરિણામ આપવાનું જાણીતું કારણ છે. યુવાન લાલ રક્તકોશો અને રેટિક્યુલોસાઇટોમાં જૂના કોષો કરતાં વધુ G6PD હોય છે. તીવ્ર હિમોલિટિક ઘટના દરમિયાન સૌથી જૂના અને સૌથી વધુ ઊણપવાળા કોષો પહેલેથી નાશ પામ્યા હોઈ શકે છે, જેથી બાકી રહેલા યુવાન કોષસમૂહની સક્રિયતા પરીક્ષણમાં સામાન્ય દેખાય છે. આ જ જૈવિક પરિસ્થિતિ પરિમાણાત્મક પરીક્ષણોને પણ ગેરમાર્ગે દોરે છે, માત્ર રંગદ્રવ્ય-આધારિત સ્ક્રીનિંગને નહીં.

તાજેતરનું રક્તસંચાર ઊણપને છુપાવે છે, કારણ કે દાતાના લાલ રક્તકોશો નમૂનામાં પોતાનું એન્ઝાઇમ ઉમેરે છે. Mayo Clinic Laboratories રક્તસંચારને એન્ઝાઇમનાં અવિશ્વસનીય પરિણામોનાં કારણોમાં ગણે છે, સાથે રેટિક્યુલોસાઇટોની સંખ્યામાં વધારો અને શ્વેત રક્તકોશોનો હસ્તક્ષેપ પણ દર્શાવે છે.

હેટેરોઝાઇગસ સ્ત્રીઓ સૌથી મુશ્કેલ સ્થિતિ છે. X-રંગસૂત્રનું અનિયત નિષ્ક્રિયકરણ સામાન્ય અને ઊણપવાળા લાલ રક્તકોશોનું મિશ્રણ બનાવે છે, અને એકંદર સક્રિયતા ગંભીર ઊણપથી લઈને દેખીતી રીતે સામાન્ય સુધી કોઈપણ સ્તરે હોઈ શકે છે. ગુણાત્મક સ્ક્રીનિંગમાં મધ્યવર્તી ફીનોટાઇપ ઘણી વાર ચૂકી જાય છે. G6PD પરીક્ષણ અંગેના WHOના દસ્તાવેજો આ મર્યાદાની વિગતવાર ચર્ચા કરે છે.

નમૂનો કેટલો જૂનો છે, સંગ્રહનું તાપમાન, દૃશ્ય અંતિમ બિંદુના આકલનની વ્યક્તિલક્ષિતા, હિમેટોક્રિટ અને અભિકર્મકોની ગુણવત્તા — આ બધું આ જૈવિક અસરો ઉપરાંત વિશ્લેષણમાં વધારાની અનિશ્ચિતતા ઉમેરે છે.

સ્ક્રીનિંગ એ નિદાન નથી

ઊણપ દર્શાવતું, મધ્યવર્તી અથવા ક્લિનિકલ સ્થિતિ સાથે મેળ ન ખાતું સ્ક્રીનિંગ પરિણામ પરિમાણાત્મક G6PD એન્ઝાઇમ પરીક્ષણની જરૂર દર્શાવે છે. WHO તાપમાન-નિયંત્રિત પરિમાણાત્મક સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રીને સંદર્ભ પદ્ધતિ માને છે. આ પરીક્ષણમાં લાલ રક્તકોશોના હિમોલાઇસેટમાં ગ્લુકોઝ-6-ફોસ્ફેટ અને NADP+ ઉમેરવામાં આવે છે, અને બનેલા NADPHને 340 nm પર વધતા શોષણ દ્વારા માપવામાં આવે છે. ફેરફારનો દર એન્ઝાઇમની સક્રિયતાના સમપ્રમાણમાં હોય છે, જેને સામાન્ય રીતે હિમોગ્લોબિનના પ્રતિ ગ્રામ દીઠ એકમો તરીકે પ્રમાણિત કરવામાં આવે છે. હાલની ક્લિનિકલ પ્રયોગશાળાની પ્રથાનો સાર G6PD સક્રિયતા માટેની Mayo પરીક્ષણ સૂચિની નોંધમાં આપવામાં આવ્યો છે.

અર્થઘટન માટે પ્રયોગશાળાએ માન્ય કરેલી સંદર્ભ શ્રેણી વપરાય છે, જે ઘણી વાર વસ્તીની સામાન્ય સક્રિયતાના સંબંધમાં રજૂ કરવામાં આવે છે. ઊણપની ચર્ચા સામાન્ય રીતે 30 ટકાની સીમા નજીક અને મધ્યવર્તી સક્રિયતાની ચર્ચા તેનાથી ઉપર કરવામાં આવે છે. G6PD પરીક્ષણો માટેના WHOના લક્ષિત ઉત્પાદન પ્રોફાઇલ્સ (2022) આ નિદાનાત્મક માળખું રજૂ કરે છે. જો તાજેતરનું હિમોલિસિસ અથવા રક્તસંચાર ફીનોટાઇપ નક્કી કરવાની પ્રક્રિયાને અવિશ્વસનીય બનાવે, તો લાલ રક્તકોશોનો સમૂહ ફરી સંતુલિત થયા પછી પરીક્ષણ ફરી કરો; મોલેક્યુલર પરીક્ષણ એન્ઝાઇમના માપનનું સ્થાન લીધા વિના વધારાની માહિતી આપી શકે છે.

જાળવવા જેવો ભેદ

આ પરીક્ષણોમાં મેથિલીન બ્લુ શરીરની બહાર વપરાતું પ્રયોગશાળાનું અભિકર્મક છે. આ મુદ્દો દર્દીને મેથિલીન બ્લુ આપવાની સલામતીની ચર્ચાથી અલગ છે, જે મેથિલીન બ્લુના ઉપયોગ માટેની મનાઈઓ અંગેના માર્ગદર્શનમાં આવરી લેવામાં આવી છે. જૈવરાસાયણિક પ્રક્રિયા બંનેને જોડે છે, કારણ કે દવા પણ NADPH પર આધારિત અપચય પર નિર્ભર છે, પરંતુ પરીક્ષણની નળીમાં રહેલું રંગદ્રવ્ય રક્તપ્રવાહમાં આપેલી માત્રા સમાન નથી. અલગ પરિસ્થિતિમાં આ રંગદ્રવ્ય અભિરંજક તરીકે કેવી રીતે વર્તે છે તે સમજવા માટે મેથિલીન બ્લુ અભિરંજનના સિદ્ધાંતો જુઓ; અને તે જે રાસાયણિક કુટુંબનો ભાગ છે તે સમજવા માટે પ્રયોગશાળામાં વપરાતા રેડોક્સ રંગદ્રવ્યો વિશે જાણો.

સ્ક્રીનિંગ પૂછે છે કે અપચાયક ક્ષમતા અખંડિત જણાય છે કે નહીં. પુષ્ટિનું પરીક્ષણ પૂછે છે કે ખરેખર કેટલું એન્ઝાઇમ હાજર છે. રંગદ્રવ્ય પહેલા પ્રશ્નનો સારી રીતે જવાબ આપે છે, જો કોઈ તેને બીજા પ્રશ્નનો જવાબ આપવા ન કહે.