DNA અને RNA સ્ટેનિંગ માટે મેથિલીન બ્લૂ: જેલ અને મેમ્બ્રેનમાં ઉપયોગ

એક વિદ્યાર્થી એગરોઝ જેલ ચલાવે છે, તેને મેથિલીન બ્લૂથી રંગે છે અને જ્યાં સ્પષ્ટ બેન્ડ અપેક્ષિત હતો ત્યાં કશું જ દેખાતું નથી. બાજુના કાર્યસ્થળે, એક પોસ્ટડોક્ટરલ સંશોધક એ જ વાદળી બોટલથી નોર્ધર્ન મેમ્બ્રેન રંગે છે અને ત્રણ મિનિટમાં સ્પષ્ટ રાઇબોસોમલ બેન્ડ મેળવે છે. વિદ્યાર્થી નિષ્કર્ષ કાઢે છે કે જેલ નિષ્ફળ ગયો. જેલ નિષ્ફળ ગયો નહોતો. બંને કાર્યો અલગ હતાં, અને એક જ રંગક તેમને અલગ સંવેદનશીલતા, અલગ પૃષ્ઠભૂમિ અને આગળની પ્રક્રિયા માટેના અલગ નિયમો સાથે જવાબ આપે છે.

મેથિલીન બ્લૂથી DNA સ્ટેનિંગ અને મેથિલીન બ્લૂથી RNA સ્ટેનિંગની રસાયણિક પ્રક્રિયા એકસરખી છે, પરંતુ હેતુ એકસરખો નથી. જેલમાં, રંગક દર્શાવે છે કે છિદ્રાળુ મેટ્રિક્સમાં કેટલો ન્યુક્લિક ઍસિડ છે. મેમ્બ્રેન પર, તે દર્શાવે છે કે ટ્રાન્સફર સફળ થયું કે નહીં અને લેનમાં સમાન પ્રમાણમાં નમૂના ભરવામાં આવ્યા કે નહીં. આ તફાવત સ્પષ્ટ થયા પછી પ્રોટોકોલ, શોધ મર્યાદાઓ અને સુસંગતતાની મર્યાદાઓ સમજાય છે.

ટૂંકો જવાબ

મેથિલીન બ્લૂ એક સમતલીય ધનાયનિક રંગક છે, જે ફોસ્ફેટ પ્રત્યેના સ્થિરવિદ્યુતીય આકર્ષણ, બેઝ-પેર વચ્ચે ઇન્ટરકેલેશન અને નાના ખાંચા સાથેના જોડાણના સંયોજન દ્વારા ન્યુક્લિક ઍસિડ સાથે અસહસંયોજક અને ઉલટાવી શકાય તે રીતે બંધાય છે. આ ઉલટાવી શકાય તેવું બંધન જ મુખ્ય બાબત છે. બેન્ડને રંગીને દૃશ્યમાન પ્રકાશમાં જોઈ શકાય છે, તેમની છબી નોંધાવી શકાય છે અને પછી ક્લોનિંગ, હાઇબ્રિડાઇઝેશન અથવા ફરી પ્રોબિંગ માટે રંગ દૂર કરી શકાય છે અથવા શુદ્ધીકરણ કરી શકાય છે.

દ્વિસૂત્રીય DNA ધરાવતા એગરોઝ જેલને મેથિલીન બ્લૂથી રંગવા માટેની પ્રમાણભૂત ઝડપી પદ્ધતિમાં પાણીમાં 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL), લગભગ 15 મિનિટનું સ્ટેનિંગ અને ત્યારબાદ લગભગ 15 મિનિટ પાણીથી રંગ દૂર કરવાનો સમાવેશ થાય છે; તેને સફેદ પ્રકાશના બોક્સ પર જોવામાં આવે છે. મેમ્બ્રેન માટેની પરંપરાગત નોર્ધર્ન બ્લોટ પદ્ધતિમાં લગભગ pH 5.2 પર સોડિયમ ઍસિટેટમાં 0.02 થી 0.04 percent રંગક વપરાય છે; ટ્રાન્સફર અને સ્થિરીકરણ પછી કેટલીક મિનિટ સ્ટેનિંગ કરવામાં આવે છે, ત્યારબાદ પાણીથી ધોવાય છે અને હાઇબ્રિડાઇઝેશન પહેલાં રંગ સંપૂર્ણપણે દૂર કરવામાં આવે છે. સંવેદનશીલતા મર્યાદિત છે: સારી પરિસ્થિતિમાં પ્રતિ જેલ બેન્ડ દસોથી સેંકડો નેનોગ્રામ, જ્યારે સાવચેતીભર્યા માર્ગદર્શકો 0.5 થી 1 microgram દર્શાવે છે. આ ઇથિડિયમ બ્રોમાઇડ અને SYBR સ્ટેનની સરખામણીમાં પરિમાણના અનેક ક્રમો જેટલું વધુ છે. મેમ્બ્રેન પર કોઈ એક ટ્રાન્સક્રિપ્ટ માટે ઉપયોગી શોધ મર્યાદા નથી, કારણ કે સ્ટેન મુખ્યત્વે વિપુલ પ્રમાણમાં રહેલું રાઇબોસોમલ RNA અને ભરેલી કુલ સામગ્રી દર્શાવે છે. આ બંને પદ્ધતિમાં છૂટક વેચાતું સપ્લિમેન્ટ દ્રાવણ વિકલ્પ તરીકે વાપરશો નહીં. માન્ય કરેલી પદ્ધતિઓ વિશ્લેષણાત્મક ગ્રેડના રંગક, નિર્ધારિત બફર અને RNA સામેલ હોય ત્યાં RNase-મુક્ત હેન્ડલિંગ ધારે છે.

બંધન કેવી રીતે થાય છે અને ક્યાં તે ભ્રમિત કરે છે

ઉપયોગી મોડેલના ત્રણ ભાગ છે. પ્રથમ, ધન વીજભાર ધરાવતી વલય પ્રણાલી ઋણ વીજભાર ધરાવતી ફોસ્ફેટની મુખ્ય શૃંખલા તરફ આકર્ષાય છે. સ્પેક્ટ્રોસ્કોપિક અભ્યાસો દર્શાવે છે કે ઓછા લવણની સ્થિતિમાં આ સ્થિરવિદ્યુતીય ઘટક પ્રબળ હોય છે, જ્યારે મોડેલિંગ અને મોલેક્યુલર ડાયનેમિક્સ દ્વિસૂત્રીય DNA માટે ઇન્ટરકેલેશન અને નાના ખાંચામાં બંધનને સ્થિર બંધનપદ્ધતિઓ તરીકે દર્શાવે છે; તેનો સારાંશ મેથિલીન બ્લૂના DNA સાથેના બંધનના સ્પેક્ટ્રોસ્કોપિક અભ્યાસમાં આપવામાં આવ્યો છે. બીજું, GC માટે થોડી પસંદગી જોવા મળે છે: મોડેલિંગ CpG અને GpC સ્ટેપ્સને વધુ અનુકૂળ દર્શાવે છે અને મેથિલીન બ્લૂની ઇન્ટરકેલેશન પસંદગીઓ અંગેના પ્રયોગોમાં GC-સમૃદ્ધ દ્વિસૂત્રીય રચનાઓ સાથે પસંદગીયુક્ત જોડાણ નોંધાયું છે, પરંતુ AT દ્વિસૂત્રીય રચનાઓ પણ બંધાય છે. નિયમિત સ્ટેનિંગ અનુક્રમ-વિશિષ્ટ નથી. ત્રીજું, એકસૂત્રીય DNA અને RNA મુખ્યત્વે સ્થિરવિદ્યુતીય ક્રિયાઓ તથા ઉપલબ્ધ બેઝ અને દ્વિસૂત્રીય વિસ્તારો સાથે સ્ટૅકિંગ દ્વારા બંધાય છે; તેથી સ્ટેનિંગની તીવ્રતા લંબાઈ, અનુક્રમ અને દ્વિતીયક રચના પ્રમાણે બદલાય છે.

આમાંથી બે પરિણામો આવે છે. બંધન અસહસંયોજક હોવાથી રંગક ધોવાઈને દૂર થાય છે. ઇરાદાપૂર્વક ફિક્સ ન કરવામાં આવે તો પોલિએક્રિલામાઇડના બેન્ડ ઝડપથી ઝાંખા પડે છે, અને સામાન્ય સ્ટેનિંગ અસ્થાયી હોવાને કારણે જ કાયમી ફિક્સેશનની વિશિષ્ટ પદ્ધતિ ઉપલબ્ધ છે, જેનું વર્ણન PAGE જેલ માટે Soto અને Draperએ કર્યું છે. રંગક પ્રકાશસંવેદક હોવાથી ઑક્સિજનની હાજરીમાં રંગેલા DNAને લાંબા સમય સુધી તેજ પ્રકાશમાં રાખવાથી ગ્વાનિનનું ઑક્સિડેશન થઈ શકે છે અને અંતે સૂત્રોમાં નિક પડી શકે છે; આ પ્રક્રિયાનું વિગતવાર વર્ણન મેથિલીન બ્લૂથી સંવેદિત ગ્વાનિન ઑક્સિડેશન અંગેના કાર્યમાં છે. થોડા સમય માટે સફેદ પ્રકાશમાં જોવાથી પરંપરાગત ઇથિડિયમ બ્રોમાઇડ કાર્યપદ્ધતિઓમાં થતું જાણીતું UV નુકસાન ટળે છે, અને તૈયારીલક્ષી પુનઃપ્રાપ્તિ માટે આ લાભ વાસ્તવિક છે. દૃશ્યમાન પ્રકાશ ઓછો નુકસાનકારક છે, સંપૂર્ણપણે નિર્દોષ નથી. DNAનું ક્લોનિંગ કરવાનું હોય ત્યારે પ્રકાશમાં રાખવાનો સમય ટૂંકો રાખો. આ સાવચેતી પાછળની વ્યાપક પ્રકાશરસાયણિક પ્રક્રિયાઓ માટે મેથિલીન બ્લૂના પ્રકાશરસાયણમાં બે માર્ગો જુઓ. ઑક્સિડાઇઝ્ડ સ્વરૂપ શા માટે બંધાય છે અને રિડ્યુસ્ડ સ્વરૂપ શા માટે બંધાતું નથી તે સમજાવતી રેડોક્સ જોડી અને વીજભાર અવસ્થાઓ માટે મેથિલીન બ્લૂની રચના અને ગુણધર્મોનું રસાયણશાસ્ત્ર જુઓ.

કાર્ય એક: જેલની અંદર સ્ટેનિંગ

જેલ સ્ટેનિંગ એક પ્રશ્નનો જવાબ આપે છે: આ બેન્ડમાં આંખે દેખાય તેટલો ન્યુક્લિક ઍસિડ છે કે નહીં. એગરોઝમાં દ્વિસૂત્રીય DNAનો કિસ્સો સૌથી સારી રીતે અભ્યાસ કરાયેલો છે. Flores અને સહકર્મીઓની મૂળ મેથિલીન બ્લૂ જેલ પદ્ધતિએ 1 percent એગરોઝ પર 0.02 percentનો ઝડપી પ્રોટોકોલ માન્ય કર્યો હતો અને પછી સફળ પુનઃપ્રાપ્તિ તથા ક્લોનિંગ દર્શાવ્યાં હતાં. એ જ સપ્લાયર પ્રોટોકોલ IBI Scientificના મેથિલીન બ્લૂ ઉત્પાદન પૃષ્ઠ પર મળે છે, જ્યાં 0.04 percentની મેમ્બ્રેન પદ્ધતિ અને ઝડપી જેલ પદ્ધતિ સાથે આપવામાં આવી છે.

વ્યવહારુ કાર્યપદ્ધતિ:

1. જેલ સામાન્ય રીતે ચલાવો. ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ પછી સ્ટેનિંગ કરો, તે દરમિયાન નહીં, સિવાય કે સુધારેલી પદ્ધતિ માટે ટ્રાન્સફર અથવા વિભેદનક્ષમતા માન્ય કરવામાં આવ્યાં હોય.
2. નિસ્યંદિત પાણીમાં 0.02 percent w/v મેથિલીન બ્લૂમાં લગભગ 15 મિનિટ ડુબાડો અને હળવેથી હલાવો.
3. પાણી ઘણી વાર બદલીને કુલ લગભગ 15 મિનિટ સુધી રંગ દૂર કરો, જ્યાં સુધી મેટ્રિક્સની પૃષ્ઠભૂમિનો રંગ ઘટે અને બેન્ડ સ્પષ્ટ દેખાય.
4. સફેદ પ્રકાશના ઇલ્યુમિનેટર પર તરત જ ફોટોગ્રાફ લો.

એગરોઝ અને પોલિએક્રિલામાઇડ અલગ રીતે વર્તે છે. એગરોઝ મેટ્રિક્સમાં રંગક જાળવી રાખે છે, તેથી રંગ દૂર કરવાનું પગલું ધીમું હોય છે. પાતળા પોલિએક્રિલામાઇડ જેલ ઝડપથી રંગાય છે, પણ રંગ ઝડપથી ગુમાવે પણ છે; આ તૈયારીલક્ષી બેન્ડ કાપીને કાઢવામાં મદદરૂપ છે, પરંતુ લાંબા ગાળાના રેકોર્ડ માટે નુકસાનકારક છે. સ્થાપિત Current Protocols પ્રકારની PAGE પદ્ધતિઓ અનુસાર, પોલિએક્રિલામાઇડમાં કૃત્રિમ ઑલિગોન્યુક્લિયોટાઇડને એ જ 0.02 percent પદ્ધતિથી વારંવાર પાણીથી ધોઈને 20 થી 30 મિનિટમાં શોધી શકાય છે. તૈયારીલક્ષી ઑલિગો માટે પાતળા TBEમાં લગભગ 0.0002 percentની ખૂબ પાતળી પદ્ધતિઓ કેટલાક કલાકો સુધી વાપરવામાં આવી હોવાના અહેવાલ છે, પરંતુ તેના પુરાવાનો આધાર નબળો છે.

DNA અને RNA વચ્ચેનો તફાવત મહત્વનો છે. દ્વિસૂત્રીય DNA સૌથી મજબૂત રચના-આધારિત બંધન આપે છે. RNA અને એકસૂત્રીય DNA રંગાય છે, પરંતુ વધુ નબળી રીતે અને ઓછી અનુમાનપાત્રતા સાથે. ફોર્માલ્ડિહાઇડ એગરોઝ RNA જેલ માટે મોટાભાગની પ્રયોગશાળાઓ જેલમાં વાદળી સ્ટેનિંગ કરવાનું ટાળે છે અને પહેલા RNAને મેમ્બ્રેન પર ટ્રાન્સફર કરીને ત્યાં સ્ટેનિંગ કરે છે. આ ફેરફાર નબળા જેલ સંકેતને બદલે વધુ સ્પષ્ટ મેમ્બ્રેન સંકેત તથા લોડિંગનો રેકોર્ડ આપે છે.

કાર્ય બે: મેમ્બ્રેન પર સ્ટેનિંગ

મેમ્બ્રેન સ્ટેનિંગ અલગ પ્રશ્નનો જવાબ આપે છે: ટ્રાન્સફર સફળ થયું કે નહીં અને લેનની સરખામણી કરી શકાય છે કે નહીં. તેનો પરંપરાગત ઉપયોગ Herrin અને Schmidtનો ઉલટાવી શકાય તેવો નોર્ધર્ન બ્લોટ સ્ટેન છે, જેમાં મૂળ રીતે pH 5.0 પર 50 mM સોડિયમ ઍસિટેટમાં 0.04 percent રંગક વડે 2 થી 3 મિનિટ સ્ટેનિંગ અને પાણીથી ધોવાનું કરવામાં આવતું હતું; હાઇબ્રિડાઇઝેશન પહેલાં SSPEમાં પાતળા SDSથી તેને દૂર કરી શકાતો હતો.

વ્યાપક રીતે વપરાતી આધુનિક પદ્ધતિ આ પ્રમાણે છે:

1. RNA અથવા ડીનેચર્ડ DNAને નાયલોન અથવા નાઇટ્રોસેલ્યુલોઝ પર ટ્રાન્સફર કરો, પછી UV ક્રોસલિંકિંગ અથવા બેકિંગ દ્વારા સ્થિર કરો, જેથી સ્ટેનિંગ દરમિયાન નમૂનો ગુમાય નહીં.
2. વૈકલ્પિક પરંતુ સામાન્ય પગલું: મેમ્બ્રેનને 5 percent ઍસિટિક ઍસિડમાં લગભગ 15 મિનિટ ભીનું કરો.
3. લગભગ pH 5.2 પર 0.3 થી 0.5 M સોડિયમ ઍસિટેટમાં 0.02 થી 0.04 percent મેથિલીન બ્લૂ વડે 5 થી 10 મિનિટ સ્ટેનિંગ કરો.
4. પાણીથી ધોવો અને 5 થી 15 મિનિટ સુધી રંગ દૂર કરો, છબી નોંધાવો અને પછી હાઇબ્રિડાઇઝેશન પહેલાં બાકી રહેલો રંગક દૂર કરો.

નોર્ધર્ન કાર્યમાં ધન વીજભારવાળા નાયલોનનો ઉપયોગ સૌથી વધુ થાય છે. નાઇટ્રોસેલ્યુલોઝ પણ એ જ ઍસિટિક ઍસિડ અને ઍસિટેટની કાર્યપદ્ધતિ સાથે કામ કરે છે. છબીનો ઉપયોગ ટ્રાન્સફરની ખાતરી કરવા, 28S અને 18S બેન્ડની સરખામણી કરવા (અથવા બેક્ટેરિયલ RNA માટે 23S અને 16S), લેડર અને ધોરણોને ચિહ્નિત કરવા અને કુલ RNAના નોર્મલાઇઝેશનનો અંદાજિત રેકોર્ડ રાખવા માટે થાય છે. પ્રકાશિત નોર્ધર્ન પદ્ધતિઓ લોડિંગ તપાસવા માટે રંગાયેલા રાઇબોસોમલ બેન્ડનું પરિમાણન કરે છે; તેમાં નોર્મલાઇઝેશન માટે મેથિલીન બ્લૂથી રંગાયેલા રાઇબોસોમલ બેન્ડ વાપરેલું ડેરી વિજ્ઞાનનું કાર્ય પણ સામેલ છે. સધર્ન મેમ્બ્રેનને પણ એ જ રીતે જોઈ શકાય છે, પરંતુ આ રંગક નોર્ધર્ન લોડિંગ અને ટ્રાન્સફરની તપાસ માટે વધુ સ્થાપિત છે; ઉપરાંત સધર્ન DNAને ટ્રાન્સફર પહેલાં ડીનેચર કરવામાં આવે છે, તેથી જેલની સંવેદનશીલતાના આંકડા અહીં લાગુ પડતા નથી.

શોધ મર્યાદાઓ અને પૃષ્ઠભૂમિ: જ્યાં વાદળી રંગ પાછળ પડે છે

નીચેની સરખામણી ઇરાદાપૂર્વક અંદાજિત છે. સ્ટેનનું પ્રદર્શન જેલની ટકાવારી, બેન્ડની પહોળાઈ, પ્રકાશીય વ્યવસ્થા અને રંગ દૂર કરવાની પદ્ધતિનું શિસ્તબદ્ધ પાલન કરવા પર આધાર રાખે છે. દરેક આંકડાને ચોક્કસ સ્પેસિફિકેશન તરીકે નહીં, પરંતુ પરિમાણના ક્રમ તરીકે ગણો.

પૃષ્ઠભૂમિનું નિયંત્રણ નક્કી કરે છે કે મર્યાદિત સંકેત ઉપયોગી છે કે નહીં. મુક્ત રંગકનો રંગ ખૂબ ગાઢ હોય છે, તેથી બંધાયેલા રંગકને દૂર કર્યા વિના ન બંધાયેલો રંગક દૂર કરવાથી કોન્ટ્રાસ્ટ મળે છે. વધુ સાંદ્ર સ્ટેન ભાગ્યે જ સંવેદનશીલતા વધારે છે. તે મુખ્યત્વે રંગ દૂર કરવાનો સમય વધારે છે. જે ચોક્કસ જેલ, મેમ્બ્રેન અને કેમેરા વાપરવાના હોય તેના પર પાતળીકરણની શ્રેણી ચલાવો અને માત્ર એ શ્રેણીનો ઉપયોગ કરો જેમાં સંકલિત ઘનતા ઇનપુટના પ્રમાણમાં રહે. મેથિલીન બ્લૂ અર્ધપરિમાણાત્મક લોડિંગ નોર્મલાઇઝેશન માટે ઉપયોગી છે. તે ઊંચી ડાયનેમિક રેન્જવાળું પરિમાણાત્મક પરીક્ષણ નથી, કારણ કે મેમ્બ્રેનની ક્ષમતા, ટ્રાન્સફરની કાર્યક્ષમતા, સંતૃપ્તિ અને રંગ દૂર થવાનું પ્રમાણ લેન પ્રમાણે બદલાય છે.

સુસંગતતાની મર્યાદાઓ: સ્ટેનિંગ પછી શું જળવાય છે

વાદળી સ્ટેનિંગ પછી ક્લોનિંગ સફળ થતું હોવાનું દર્શાવાયું છે. Flores અને સહકર્મીઓએ રંગાયેલા એગરોઝ બેન્ડ કાપીને કાઢ્યા, DNA પુનઃપ્રાપ્ત કર્યો અને તેનું લિગેશન તથા ટ્રાન્સફોર્મેશન કર્યું; તેમણે UV સાથે ઇથિડિયમ બ્રોમાઇડ વાપર્યા પછીની સરખામણીમાં વધુ સારું ક્લોનિંગ નોંધ્યું. સંભવિત કારણ ઓછું પ્રકાશજન્ય નુકસાન છે, રંગકથી થતો કોઈ સીધો લાભ નહીં. સફેદ પ્રકાશમાં રાખવાનો સમય ટૂંકો રાખો અને પુનઃપ્રાપ્ત DNAને સામાન્ય જેલ એક્સ્ટ્રૅક્શન શુદ્ધીકરણમાંથી પસાર કરો.

PCR અને સિક્વેન્સિંગ માટેના પુરાવા ઓછા છે. અવશેષ રંગક ન્યુક્લિક ઍસિડ સાથે બંધાય છે, તેથી એન્ઝાઇમ આધારિત પગલાં પહેલાં રંગ દૂર કરો અને શુદ્ધીકરણ કરો. વાદળી જેલમાંથી યોગ્ય રીતે શુદ્ધ કરાયેલ DNA કામ કરે તેવી અપેક્ષા છે, પરંતુ વિવિધ પોલિમરેઝ અને સિક્વેન્સિંગ રસાયણોમાં સીધા સાથે જતા અવશેષ રંગકની સહનશીલતાનું પૂરતું પરિમાણન થયું નથી. તે અંગે ધારણા ન બાંધો.

પગલાંનો ક્રમ કડક રીતે અનુસરવામાં આવે ત્યારે બ્લોટ હાઇબ્રિડાઇઝેશન સુસંગત છે: ટ્રાન્સફર, સ્થિરીકરણ, સ્ટેનિંગ, નોંધણી, રંગ દૂર કરવો, હાઇબ્રિડાઇઝેશન. આ ક્રમ Herrin અને Schmidtની રચના છે. ટ્રાન્સફર પહેલાં સ્ટેનિંગ કરવું અથવા રંગ દૂર કરવાનું છોડવું એ અલગ પદ્ધતિ છે અને તેની પોતાની માન્યતા તપાસવી જરૂરી છે. રંગક દૂર કર્યા પછી પ્રમાણભૂત પ્રોબ સ્ટ્રિપિંગ અને ફરી પ્રોબિંગ સામાન્ય રીતે થઈ શકે છે. એ જ રંગક પરિવાર વડે કોષ સ્તરના સ્ટેનિંગ અને ફિક્સ કરેલી ફિલ્મની પદ્ધતિનો તર્ક જીવંત કોષની પદ્ધતિઓને શા માટે લાગુ પડતો નથી તે માટે માઇક્રોસ્કોપી સ્ટેનિંગ ઍટલસ જુઓ.

કાયમી ફિક્સેશનની પદ્ધતિ ટાળવામાં આવે તો તૈયારીલક્ષી એગરોઝ અને વાદળી રંગ વડે ઓળખાયેલા PAGE ઑલિગો માટે બેન્ડ કાપીને કાઢવાનું કાર્ય કરે છે. ઉલટાવી શકાય તે રીતે બંધાતા રંગક માટે રંગ દૂર કર્યા પછી ઇલેક્ટ્રોએલ્યુશન રસાયણિક રીતે શક્ય લાગે છે, પરંતુ મેથિલીન બ્લૂ માટે વિશિષ્ટ નિયંત્રિત ઉપજના આંકડા ઓછા છે. એલ્યુશન પછી લવણ દૂર કરો અથવા અવક્ષેપણ કરો.

વારંવાર થતી નિષ્ફળતાઓ

ઝાંખા જેલ બેન્ડ સામાન્ય રીતે રંગમાપક સ્ટેન માટે ખૂબ ઓછી માત્રા દર્શાવે છે, ખાસ કરીને ટૂંકા એકસૂત્રીય અથવા RNA લક્ષ્યો માટે. વધુ નમૂનો ભરો, તાજું સ્ટેન વાપરો, સાંદ્રતા વધારતાં પહેલાં સ્ટેનિંગનો સમય વધારો અને રંગ દૂર કરવાનું વહેલું બંધ કરો. કોન્ટ્રાસ્ટ વગરનો સંપૂર્ણ વાદળી જેલ સામાન્ય રીતે વધુ પડતું સ્ટેનિંગ અથવા પાણી પૂરતી વાર ન બદલવાનું દર્શાવે છે. PAGE બેન્ડ ઝાંખા પડવા એ અપેક્ષિત રસાયણિક વર્તન છે, નિષ્ફળ સ્ટેનિંગ નહીં. ઝડપથી ફોટોગ્રાફ લો. મેમ્બ્રેનની અસમાન પૃષ્ઠભૂમિ વળાંક, પરપોટા, આંગળીના નિશાન, અસમાન હલનચલન અથવા ટુકડાઓમાં થયેલું ટ્રાન્સફર સૂચવે છે. હાઇબ્રિડાઇઝેશન નિયંત્રણ વિના તેને અસમાન લોડિંગ તરીકે ન ગણો. ફેલાયેલો નબળો રાઇબોસોમલ પેટર્ન વિઘટન સૂચવી શકે છે, પરંતુ તે અધૂરું ટ્રાન્સફર, ખૂબ ઓછું કુલ RNA (સામાન્ય લેનમાં કેટલાકથી લઈને દસોના પ્રમાણમાં માઇક્રોગ્રામ હોય છે) અથવા વધુ પડતો રંગ દૂર કરવાથી પણ થઈ શકે છે. રંગક વિપુલ પ્રમાણમાં રહેલું રાઇબોસોમલ RNA દર્શાવે છે. તે કોઈ ચોક્કસ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ દર્શાવતો નથી. એ કામ પ્રોબનું છે.

અતિશય દાવા વિના સલામતી અને હેન્ડલિંગ

મેથિલીન બ્લૂને હેન્ડલ કરવું ઇથિડિયમ બ્રોમાઇડ કરતાં સરળ છે, પરંતુ તે નિર્દોષ નથી. હાલની MilliporeSigma સલામતી માહિતી પત્રિકા રંગકને તીવ્ર મૌખિક વિષાક્તતા Category 4માં વર્ગીકૃત કરે છે, ગળી જવાથી હાનિકારક ગણાવે છે અને Sigma-Aldrichની મેથિલીન બ્લૂ SDS અનુસાર માન્ય કચરા નિકાલ પદ્ધતિ દ્વારા નિકાલ કરવા જણાવે છે. ઇથિડિયમ બ્રોમાઇડ માટે વધુ કડક જનીનવિષાક્તતાની ચેતવણીઓ છે, જેમાં તેની Sigma-Aldrich ઇથિડિયમ બ્રોમાઇડ SDSમાં જનનકોષો પર શંકાસ્પદ અસરોનો સમાવેશ થાય છે; તેના જેલ અને દ્રાવણોને સામાન્ય રીતે જોખમી રસાયણિક કચરા તરીકે અલગ રાખવામાં આવે છે, જેમ Thermo Fisherની ન્યુક્લિક ઍસિડ સ્ટેન માર્ગદર્શિકામાં નોંધ્યું છે. બંને માટે SDS અને સંસ્થાના નિયમોનું પાલન કરો. સૂકા રંગકને ચુસ્ત બંધ અને સૂકો રાખો, ઉપયોગમાં લેવાતા સ્ટેનનો ફરી ઉપયોગ માત્ર પ્રોટોકોલની મંજૂરી મુજબ કરો, રંગાયેલા મેમ્બ્રેનને ફિલ્ટર શીટ વચ્ચે સૂકા સંગ્રહો અને બેન્ડ વિસરણથી ફેલાઈ જાય તે પહેલાં જેલના ફોટોગ્રાફ લો.

પ્રયોગશાળાનો આ સાર યાદ રાખો. જેલ સફેદ પ્રકાશમાં વધુ લોડ પર દેખાવાની ક્ષમતા તપાસે છે. પ્રોબ સંવેદનશીલ કાર્ય કરે તે પહેલાં મેમ્બ્રેન ટ્રાન્સફર અને લોડિંગ તપાસે છે. એક જ રંગક બંને કામ કરે છે, પરંતુ તેની સંવેદનશીલતા મર્યાદિત છે, બંધન ઉલટાવી શકાય તેવું છે અને પ્રક્રિયાના પગલાંનો ક્રમ કડક રીતે અનુસરવો પડે છે.