Kann metylenblátt fara fram hjá mitokondriukompleksi III? Hví kanningar eru ósamdar

Tvær rannsóknarstovur kannaðu, um metylenblátt kann fara fram hjá einum tálmaðum mitokondriukompleksi III. Onnur svaraði nei. Hin svaraði ja. Báðar høvdu dátur.

Fyrsta kanningin, í mitokondrium úr músaheila, vísti, at litievnið ikki kann tað. Onnur, í heilamitokondrium úr trimum nagdjórasløgum, vísti, at tað lutvíst kann. Ein triðja kanning, í músalivur, verður ofta nevnd í sama høpi, men kannaði nakað annað. Halt hana í sínum rætta samanhangi, so hvørvur helvtin av ørkymlanini.

Her er eingin algildur mekanisma at kunngera. Her eru tríggjar royndir við ymiskum tálmarum, skamtum og mátingum. Les royndarumstøðurnar fyrst. Niðurstøðurnar fylgja av teimum.

Hvat tað merkir at fara fram hjá her

Elektronir koma inn í ketuna gjøgnum kompleks I (frá NADH) ella kompleks II (frá succinati), fara gjøgnum kompleks III til cytokrom c og síðani gjøgnum kompleks IV til súrevni. Gradienturin, sum verður bygdur upp á leiðini, er tað, sum kyknan nýtir til at framleiða ATP.

Ein pástandur um eina leið fram hjá einum tálmaðum kompleksi sigur, at metylenblátt tekur við elektronum áðrenn tálmingina og letur tær frá sær aftan fyri hana. Oxideraða litievnið tekur elektronir frá NADH ella frá pørtum tíðliga í ketuni og verður til leukometylenblátt. Reduseraða formurin letur tær síðani til cytokrom c ella aftur inn í ketuna. Verða elektronirnar latnar aftan fyri tálmingina, koma anding og membranpotential lutvíst aftur. Verða tær latnar við tálmingina ella áðrenn hana, kemur einki aftur.

Ein einstøk smálutur við kompleksi III er avgerandi fyri nógv av hesum ósamljóði. Kompleksið rekur eina Q-ringrás við tveimum støðum, har tálmarar kunnu bindast. Antimycin bindur seg til Qi-staðið. Myxothiazol bindur seg til Qo-staðið. Ein kanning, sum bert nýtir annað teirra, hevur bert kannað helvtina av kompleksinum.

Fyrsta kanningin: eingin leið fram hjá í mitokondrium úr músaheila

Gureev og starvsfelagar nýttu mitokondriur úr heilabørkinum hjá C57BL/6-músum, avbyrgdar við digitonini og kannaðar við 0.1 mg av proteini fyri hvønn ml. Substratini fevndu um tríggjar samansetingar: pyruvat saman við malati, 5 mM av hvørjum, succinat við 10 mM saman við glutamati við 2 mM og L-prolin við 10 mM. Tálmararnir vóru rotenon við 1 micromolar (kompleks I) og antimycin við 1 microgram fyri hvønn ml (kompleks III). Litievnisskamtarnir vóru 0.5, 1 og 2 micromolar, við 1 micromolar sum høvuðsstyrki. Háttaløg og mátikurvur eru í stuttu greinini í FEBS Letters.

Leiðin fram hjá kompleksi I virkaði. Rotenon minkaði ADP-stimbraða anding úr umleið 121 niður í umleið 2 nmol um minuttin fyri hvørt mg, og litievni við 1 micromolar fekk hana upp aftur á umleið 21. Membranpotentialið kom aftur við pyruvati saman við malati og við L-prolini.

Leiðin fram hjá kompleksi III virkaði ikki. Antimycin minkaði andingina niður í umleið 16, og litievnið flutti hana bert upp á umleið 20. Membranpotentialið kom ikki aftur við nøkrum substrati, heldur ikki við litievnisskamtum upp til 5 micromolar. Peroksiddáturnar bentu sama veg: litievnið einsamalt økti peroksidútlátið úr einum grundstigi nær 76 pmol um minuttin fyri hvørt mg upp í umleið 1170, 1460 og 1945 við teimum trimum skamtunum. Men antimycin minkaði hetta litievnisdrivna signalið við ávikavist umleið 25, 88 og 96 prosentum. Um reduserað litievni reageraði beinleiðis við súrevni, átti tálming av kompleksi III ikki at minka signalið. Høvundarnir drógu ta niðurstøðu, at reduseraða litievnið verður oxiderað við Qo-staðið á kompleksi III, áðrenn antimycin-tálmingina. Stutta ringrásin, lýst við orðum: gevarar til litievni, litievni til Qo, síðani vanliga leiðin víðari. Farið verður fram hjá rotenoni. Farið verður ikki fram hjá antimycini.

Onnur kanningin: lutvís leið fram hjá í trimum djórasløgum, við báðum tálmingarstøðunum

Svab og starvsfelagar víðkaðu royndarsniðgevingina. Heilamitokondriur úr músum, rottum og marsvínum vórðu avbyrgdar við Percoll og kannaðar við somu 0.1 mg fyri hvønn ml, við pyruvati saman við malati ella glutamati saman við malati, 5 mM av hvørjum. Tey nýttu tveir tálmarar av kompleksi III: antimycin A við 0.3 micromolar og myxothiazol við 1 micromolar. Litievnisstyrkin var 2 micromolar í flestu royndunum og 0.5 í arbeiðinum við cytokromi c. Øll trý djórasløgini, kannað við samsvarandi royndarmannagongdum, eru við í greinini við opnari atgongd.

Farið varð lutvíst fram hjá báðum tálmingunum í øllum trimum djórasløgum. Í músamitokondrium tálmaði antimycin andingina, og litievnið økti hana við umleið 60 prosentum, úr umleið 37 upp í 59 nmol um minuttin fyri hvørt mg. Myxothiazol minkaði hana við 88 prosentum, niður í umleið 4.5, og litievnið fimmfaldaði hana upp í umleið 23. Við báðum tálmarum kom membranpotentialið lutvíst aftur. Tað varð mátað við tveimum litievnum (safranin O og lutfalsmálandi TMRM) fyri at útiloka optiskar mátivillur.

Henda greinin kannaði eisini sjálva elektronflutningin beinleiðis, sum fyrsta kanningin ongantíð gjørdi. Tilsett acetýlerað cytokrom c við 25 micromolar varð ikki reduserað av mitokondrium við uppbygdum orkugradienti, hvørki við ella uttan tálmarar. Men tá litievni varð tilsett, setti tað reduktión í gongd í báðum førum. Í einum buffara uttan kyknur reduseraðu NADH og litievnið saman cytokrom c við einari ferð, sum var lutfalslig við NADH. Longra lopið, lýst við orðum: reduktiónsekvivalentar til litievni, litievni beinleiðis til cytokrom c, kompleks IV til súrevni. Henda leiðin fer heilt fram hjá kompleksi III, so til ber at fara fram hjá báðum tálmarunum.

Tvær eyka mátingar stuðla hesi tulking. NAD(P)H-fluorescensurin minkaði, tá litievni varð tilsett mitokondrium, sum vóru viðgjørdar við myxothiazoli. Tað merkir, at reduktiónsekvivalentar fluttu gjøgnum nýggju leiðina. Og ljósabsorptiónin hjá litievninum við 660 nm fylgdi hvørjari tilseting eftir tørni. Samstundis vístu yvirflot frá sentrifugering, at oxiderað litievni savnaðist inni í mitokondrium við uppbygdum orkugradienti í meira enn hundraðfaldaðari styrki og síðani fór út aftur, tá potentialið fall saman. Protonroknskapurin samsvarar eisini: tá pumpustigini verða lopin um, verða umleið 2 protonir eftir fyri hvørt elektronpar í staðin fyri 10. Tí er skjótari súrevnisnýtsla saman við bert lutvísari endurpolariser­ing júst tað, sum eyðkennir eina veruliga leið fram hjá, og ikki prógv ímóti henni.

Sama mitokondriupreparat gav úrslit, sum lætt verða mistulkað við leysari lesing. Við tálmara og litievni minkaði ADP andingina í staðin fyri at økja hana, og tálming av flutningi stimbraði hana í staðin fyri at seinka henni, meðan membranpotentialið framvegis broyttist í vanligu ættirnar. Súrevnisnýtsla einsamøll er villleiðandi í hesi skipan.

Triðja kanningin: livrakanningin, sum kannaði kompleks I og II, ikki III

Lee og Boelsterli nýttu mitokondriur úr músalivur og dyrkaðar livrakyknur, sum vóru skaddar av efavirenzi (kompleks I, IC50 nær 30 micromolar) og hydrazini, umbrotsevninum hjá isoniazidi (kompleks II, IC50 nær 30 micromolar). Litievni við umleið 30 micromolar endurreisti NADH-oxidatión, membranpotential og ATP, samstundis sum tað minkaði oxiderandi evni og nekrotiskan kyknudeyða. Greinin í Redox Biology lýsir hetta við einum myndli, har litievnið flytur elektronir fram hjá skaddu kompleksunum I og II.

Hetta úrslitið er staðfestur bakgrundarvitni um tað, sum hendir fyrr í ketuni. Tað sigur einki um kompleks III, tí einki varð tálmað har. Tað kann hvørki vátta ella afturvísa nakra av heilakanningunum.

Yvirlit yvir royndarumstøðurnar

Fýra orsøkir til, at báðar kompleks III-kanningarnar kunnu hava rætt um sína egnu uppseting

1. Tálmingin var ikki sama inntriv. Antimycin einsamalt við 1 microgram fyri hvønn ml mótvegis antimycini við 0.3 micromolar umframt einum serstøkum tálmara av Qo-staðnum. Ein litievnisleið, sum letur elektronir inn á Qo-staðið, miseydnast júst har, sum ein beinleiðis leið til cytokrom c eydnast. Eitt stað kann ikki umboða bæði.

2. Litievnisskamturin og tíðin vóru ymisk. Høvuðsstyrkir á 1 mótvegis 2 micromolar hjá einum evni, sum skiftir ímillum redox-støður, og har upptøka og beinleiðis reduktión av cytokromi c eru treytaðar av styrki og tíð. Smáir skamtamunir saman við ymiskum mátitíðspunktum kunnu vísa ymiskar greinar av sama neti.

3. Mitokondriupreparatini vóru ymisk. Avbyrging við digitonini mótvegis avbyrging við einum Percoll-gradienti velur mitokondriubólkar, sum skarast, men ikki eru eins. Proteinstyrkin samsvaraði við 0.1 mg fyri hvønn ml, so tann broytan kann útilokast, men tað kunnu undirbólkar og óskaddni ikki. Og illgrunin um djóraslagið varð afturvístur: seinni bólkurin endurskapti eisini sama fyribrigdið í músum.

4. Substratstøðan avger, hvat litievnið kann gera. Tríggjar substratsamansetingar mótvegis NADH-tengdum pørum. NADH-veiting og membranpotential avgera í felag, hvussu skjótt litievnið verður reduserað, og hvar tað savnast. Ein leið, sum krevur reduserað litievni við síðuna av oxideraðum cytokromi c, er treytað av hesum valinum.

Soleiðis metir tú um næsta pástand um eina leið fram hjá

Spyr, hvat kompleks varð tálmað, við hvørjum tálmara, á hvørjum staði og við hvørjum skamti. Spyr um litievnisstyrkina og nær mátingin varð gjørd. Spyr um vevnað, djóraslag, avbyrging, proteinstyrki og substrat. Og spyr, um potential, anding, redox-støða og ein beinleiðis roynd av elektronflutningi samsvara, tí súrevnisnýtsla einsamøll bendi skeivan veg meira enn eina ferð her.

Avmarkaða niðurstøðan stendur við. Semja er um, at litievnið kann fara fram hjá kompleksi I. Við kompleksi III vísa músamitokondriur við antimycini á 1 microgram fyri hvønn ml og litievni á 1 micromolar onga virkna leið fram hjá. Hinvegin vísa trý djórasløg við antimycini á 0.3 micromolar ella myxothiazoli á 1 micromolar og litievni á 2 micromolar eina lutvísa leið fram hjá við beinleiðis elektronflutningi frá litievni til cytokrom c. Báðar hesar staðfestingarnar kunnu vera rættar samstundis. Alt, sum røkkur longri, er ekstrapolatión.

Viðkomandi lesnaður heldur umstrídda pástandinum innan fyri óumstrídda evnafrøði: hvussu metylenblátt flytur elektronir um flutningsliðini, royndirnar við leiðini fram hjá kompleksi I um staðfesta fyribrigdið fyrr í ketuni, mátingar av membranpotentiali og mátivillur teirra um, hví tvey litievni vóru neyðug, og handfaring á rannsóknarstovu av evnum, sum skifta ímillum redox-støður, um fellurnar í skamtseting og tíðarvali.