Alternativ til metylenblátt fyri mikroskopi: vel eftir uppgávu

Til eitt einfalt bakteriuútsmet kann kristalfjølublátt koma í staðin fyri metylenblátt, tá endamálið er at síggja skapið á kyknunum. Til livandi kyknur kann eitt betri alternativ vera fasukontrastur heilt uttan litun. Valið veldst um ta eygleiðingina, tú skalt gera.

Hugsa tær, at tvey fólk kanna somu bakteriu-rækt. Annað vil skilja stavlagaðar kyknur frá rundum kyknum. Hitt vil vita, um ein viðgerð hevur dripið bakteriurnar. Ein litun, sum gevur fyrra persóninum eina greiða mynd, kann geva hinum onki brúkiligt svar.

Áðrenn tú velur eitt staðgengilsevni, fullfør henda setningin: “Eg skal eygleiða ___ í ___, og kyknurnar skulu / nýtast ikki at vera livandi.” Hesin setningurin skilmarkar uppgávuna, sum litunin skal loysa.

Byrja við sýninum og spurninginum

Avger fyrst, um kyknurnar skulu vera livandi, og staðfest síðan, hvat tú skalt eygleiða:

• Kyknurnar skulu vera livandi: til rørslu ella skap kanst tú umhugsa fasukontrast ella DIC uttan litun; til DNA í kjarnanum kanst tú umhugsa Hoechst 33342 við fluorescens; til heilleika á frumuhimnuni skalt tú velja eina staðfesta kanning, til dømis SYTO 9 saman við propidium iodide.
• Kyknurnar nýtast ikki at vera livandi: til bakteriumorfologi kanst tú umhugsa einfalda litun við kristalfjølubláum ella negativa litun við nigrosini; til Gram-reaktión skalt tú brúka fullfíggjaða Gram-litunarháttin; til DNA í kjarnanum í fikseraðum kyknum kanst tú umhugsa DAPI-fluorescens.

Brúka hesa talvuna til at samanbera avmarkingarnar í hvørjari grein. Hetta eru val av háttalagi, ikki leiðbeiningar um at skifta fløskur út í einari verandi mannagongd.

Til eitt einfalt útsmet: skift háttalagið varliga út

Kristalfjølublátt er eitt praktiskt alternativ, tá uppgávan er at fáa eina einlitaða mynd av bakteriumorfologi. Bacteriological Analytical Manual hjá FDA nevnir tvær samansetingar við kristalfjølubláum, sum hóska til einfalda litun. Brúka eina skjalprógvaða samanseting og tilhoyrandi fyrireikingarhátt; navnið á litievninum einsamalt lýsir ikki eitt arbeiðsklárt reagens.

Kristalfjølublátt verður eisini brúkt í Gram-litun, men tað ger ikki eina einfalda litun við kristalfjølubláum til eina Gram-litun. Í Gram-litunarprotokollini hjá ASM er tað ymiska úrslitið treytað av, at kristalfjølublátt, jod, avliting og mótlitun virka í røð. Um hesi stig verða lopin um, broytist tað, sum myndin kann staðfesta. Sí einføld litun samanborið við Gram-litun fyri at síggja henda munin.

Nigrosin gevur ein annan hátt at gera útlínur sjónligar: tað ger bakgrundina myrka, meðan bakteriu-kyknurnar verða verandi lutfalsliga ljósar. Ein týdningarmikil detalja í leiðbeiningini hjá Merck til nigrosin kann verða gloymd í einum vanligum lista yvir staðgenglar. Ásetta arbeiðssamansetingin hjá teimum inniheldur formaldehyd. Tí kanst tú ikki út frá orðunum “negativ litun” einsamøllum gera av, um hátturin hóskar til livandi kyknur, hóast kyknurnar sjálvar síggja ólitaðar út. Kanna alla samansetingina og fyrireikingina av sýninum.

Til livandi sýni: umhugsa at broyta optikkin

Vilt tú eygleiða kyknur, meðan tær flyta seg ella býta seg, kann eitt annað litievni gera eygleiðingina fløktari. Sum Nikon greiðir frá í vegleiðingini um kontrast í gjøgnumskygdum sýnum, gera fasukontrastur og differential interference contrast, ella DIC, sýni sjónlig við munum í optisku eginleikunum hjá teimum. Hesi háttaløg kunnu vísa livandi, ólitaðar kyknur, treytað av at mikroskopið hevur neyðugu lutirnar.

Hetta valið varðveitir eina ólitaða fyrireiking, men tað broytir, hvørjar upplýsingar tú fært. Tú kanst fylgja einum marki ella einari rørslu uttan at vita, hvat molekyl skapti kontrastin. Er spurningurin, hvar eitt ávíst molekyl er staðsett, skalt tú heldur velja ein hóskandi merkingarhátt.

Til DNA í kjarnanum skilur samanberingin hjá Invitrogen av DAPI og Hoechst-litingum millum vanliga nýtslu av DAPI við fikseraðum kyknum og tað meira frumugjøgnumgongda Hoechst 33342, sum verður valt til merking av livandi kyknum. Bæði krevja fluorescensútgerð. Einki teirra er ein beinleiðis staðgengil fyri eina litaða brightfield-litun.

Viðger útseting fyri litievni og ljós sum royndarskilyrði. Samanber litaðar og ólitaðar fyrireikingar, tá atferðin hjá kyknunum er tað, tú mátar.

Ein reyð kykna er ikki sjálvvirkandi ein deyð kykna

SYTO 9 og propidium iodide verða ofta brúkt saman til at meta um heilleikan á bakteriu-frumuhimnum. BacLight-handbókin knýtir heilar himnur at grønari litun og skaddar himnur at reyðari litun. Henda tulkingin má staðfestast fyri tað ítøkiliga sýnið.

Ein kanning frá 2019 eftir Rosenberg og starvsfelagar vísir trupulleikan. Í 24-hour E. coli-biofilmum á glasi í phosphate-buffered saline sóu umleið 96% av kyknunum út til at vera propidium-iodide-positivar in situ. Kortini mettu høvundarnir, at 82% kundu dyrkast eftir innsavning. Konfokalar myndir vístu kyknur við grønum innihaldi undir reyðlitaðum tilfari, sum bendi á, at ekstracellulerar nukleinsýrur høvdu givið villleiðandi signal.

Hesi prosenttøl lýsa ymiskar mátingar á fyrireikingunum í kanningini, ikki ein almennan rættleiðingarfaktor. Týdningarmikla niðurstøðan er at kanna, hvat skapti signalið. Í einum biofilmi kann eitt nukleinsýru-litievni ávísa tilfar uttan fyri kyknurnar eins væl og inni í skaddum kyknum. Til eina niðurstøðu um lívføri mæla granskararnir til at brúka ískoytismátingar, til dømis dyrking ella metaboliskan aktivitet, samstundis sum teir viðurkenna, at hvør háttur hevur sínar avmarkingar.

Kanna, hvat alternativið veruliga inniheldur

Ein annar litunarháttur kann framvegis innihalda metylenblátt. Giemsa er eitt dømi: Merck lýsir vøruna sum eina azure-eosin-methylene-blue loysn, ætlaða til nýtslu millum annað við blóð- og beinmergsútsmetum. Tað kann vera eitt annað háttalag til eitt annað sýni, men tað lýkur ikki eitt krav um at útiloka metylenblátt.

Um tað er partur av royndini at útiloka eitt ávíst evni, skalt tú kanna samleikan og samansetingina á reagensinum, áðrenn tú samanber myndir. Vegleiðingin um methyl blue, methylene blue og litievni við líknandi nøvnum greiðir frá navnamununum.

Staðfest útskiftingina, áðrenn tú brúkar úrslitið

Til ein nýggjan hátt skalt tú gera eina lítla samanbering við umboðandi sýnum og einum hóskandi eftirliti. Halt mikroskopstillingarnar samanberiligar, har tað ber til. Skráset samansetingina á reagensinum, fyrireikingina av sýninum, útsetingina og myndatøkuskilyrðini, so ein mynd, ið sær betri út, kann kannast nærri í staðin fyri bara at verða vald framum.

Met um úrslitið út frá upprunaliga spurninginum. Til morfologi skalt tú meta um, hvørt mørkini og skipanin hjá kyknunum framvegis kunnu tulkast. Til merking av kjarnanum skalt tú meta um staðsetingina á signalinum og bakgrundina. Til lívføri skalt tú krevja próvtilfar umframt eina sjónliga tiltalandi litaskiljing. Breiðari vegleiðingin um litun við metylenbláum og nýtslu á starvsstovu greiðir frá, hvussu eygleiðingin og fyrireikingin hanga saman.

Vel tað alternativið, sum varðveitir ta mátingina, tú hevur tørv á. Litur er bert ein eginleiki við endaligu myndini.