Metyleenisinisen absorptiospektri ja molaarinen absorptiokerroin: mittausolosuhteilla varustettu viiteaineisto

Metyleenisinisen spektri näyttää yksinkertaiselta, kunnes yrität käyttää siitä saatua lukuarvoa uudelleen. Yksi laboratorio ilmoittaa molaariseksi ekstinktiokertoimeksi noin 82,000. Toinen ilmoittaa 67,000. Kolmas ilmoittaa yli 100,000. Kaikki kolme voivat kuvata omia mittauksiaan oikein, eikä yksikään niistä ole väriaineen yleispätevä vakio.

Epäselvyys johtuu kahden eri käsitteen sekoittamisesta. Absorbanssi on tietyssä kyvetissä tietystä liuoksesta tehty mittaus. Molaarinen absorptiokerroin, jota merkitään usein epsilonilla, on kyseistä liuosta kuvaavan mallin parametri. Kun metyleenisinisen assosiaatiotila muuttuu, malli muuttuu ja siten myös parametri muuttuu. Hyödyllinen käytäntö on käsitellä jokaista kerrointa olosuhteilla varustettuna arvona: aallonpituus, liuotin, pH tai puskuri, lämpötila, pitoisuusalue ja optinen matka kulkevat lukuarvon mukana.

Monomeerin absorptiokaista laimeassa vesiliuoksessa

Laimeassa vesiliuoksessa metyleenisinikationin hallitseva absorptiokaista sijaitsee noin 664–665 nm:n kohdalla. Eri laitteilla ja kalibrointivalinnoilla sen sijainniksi ilmoitetaan tavallisesti 664–668 nm. Tämä kaista soveltuu kvantitatiiviseen määritykseen, kun liuos on niin laimea, että suurin osa väriaineesta on monomeerimuodossa.

Kolme kirjallisuusarvoa havainnollistavat, miksi olosuhteet ovat tärkeämpiä kuin yksittäinen lukuarvo. Savitutkijat, jotka pitivät vesinäytteiden pitoisuuden alle noin 7 mikromolaarisena ja käyttivät 1 cm:n kyvettejä, ilmoittivat epsilonin arvoksi noin 82,000 M-1 cm-1 aallonpituudella 665 nm. Tämä arvo on poikkeuksellisen hyvin dokumentoitu erittäin laimeiden vesinäytteiden empiirisen kalibroinnin kulmakertoimena. Myöhemmässä deionisoidussa vedessä tehdyssä alkuperäisessä kalibrointitutkimuksessa, jossa pitoisuusalue oli 2.34–37.52 mikromolaarinen ja optinen matka 1 cm, kokonaisväriaineen arvoksi saatiin noin 67,100 M-1 cm-1 aallonpituudella 665 nm. Pienempi tulos on odotettu eikä ristiriitainen, sillä kalibrointialueen ylemmällä puoliskolla on jo merkittävästi dimeeriä. Kolmas arvo, noin 73,460 M-1 cm-1 aallonpituudella 664 nm, on peräisin tutkimuksesta, joka tehtiin pH:ssa 6.86 ja lämpötilassa 293 K ja jossa havaittu spektri erotettiin monomeeri- ja dimeeriosiin. Tätä käsitellään tuoreessa metyleenisinisen fotofysiikkaa tarkastelevassa kriittisessä katsauksessa. Kyseinen lukuarvo kuvaa dekonvoluutiolla erotettua monomeerikomponenttia, ei absorbanssin suoraa kulmakerrointa kokonaisväriainepitoisuuden funktiona.

Käytännön johtopäätös: valitse kerroin, jonka olosuhteet vastaavat näytteitäsi, tai tee oma kalibrointi. Älä käytä arvoa 82,000 määrityksessä, jossa liuos on 30 mikromolaarinen ja sisältää fosfaattipuskuria, ja oleta lineaarisuuden säilyvän.

Lyhyen aallonpituuden olake on sekoitus

Pitoisuuden kasvaessa noin 600–615 nm:n kohdalla oleva olake kasvaa suhteessa 664 nm:n huippuun. Nykyisissä tutkimuksissa H-tyypin dimeerin osuus sijoitetaan yleensä noin 605–610 nm:n kohdalle. Metyleenisinisen vesiliuosten kokonaisvaltainen spektrianalyysi erottaa dimeerin maksimin aallonpituudella 607 nm ja suuremman aggregaatin maksimin aallonpituudella 600 nm sekä monomeerin resonanssikomponentit aallonpituuksilla 664 ja 650 nm. Koko teksti on saatavilla avoimesta julkaisutietueesta PMID 33251415.

Tätä olaketta ei pidä nimetä puhtaaksi dimeerin absorbanssiksi. Myös monomeerin vibroninen rakenne vaikuttaa samalla alueella, joten mitattu korkeus muodostuu päällekkäisistä osuuksista. Yhdessä kokonaisvaltaisessa sovituksessa monomeerin ja dimeerin sisältävä malli ei toiminut koko pitoisuusalueella 1.1 mikromolaarisesta 3.4 millimolaariseen. Tetrameerin lisääminen tuotti parhaan sovituksen, ja tetrameerin signaali oli havaittavissa jo alle 34 mikromolaarisessa pitoisuudessa. Sovitettujen komponenttien absorptiokertoimet olivat suuria: monomeerin pääkomponentille noin 107,800 M-1 cm-1 aallonpituudella 664 nm, dimeerille noin 101,400 aallonpituudella 607 nm ja tetrameerille noin 138,500 aallonpituudella 600 nm. Liuottimena oli puskuroimaton deionisoitu vesi, natriumkloridipitoisuus vaihteli välillä 0–0.15 M ja lämpötila välillä 282–333 K. Nämä ovat mallilla erotettuja osuuksia, joten niillä ei saa korvata empiiristä Beer–Lambert-kulmakerrointa.

Dimerisoitumisen voimakkuutta on määritetty myös suoraan. Yhdessä tutkimuksessa dimerisoitumisvakioksi saatiin noin 3,900 M-1 pH:ssa 6.86 ja lämpötilassa 293 K. Tämä suuruusluokka selittää, miksi 5 mikromolaarinen käyttöliuos käyttäytyy lähes lineaarisesti mutta 50 mikromolaarinen kantaliuos ei. Menetelmän kehittämisessä hyödyllinen tarkistus on noin 610 nm:n kohdalla mitatun absorbanssin suhde noin 665 nm:n kohdalla mitattuun absorbanssiin. Kun tämä suhde kasvaa pitoisuuden mukana, epsilon aallonpituudella 664 nm ei enää kuvaa yhtä muuttumatonta kemiallista muotoa.

Pitoisuusalueella, jota hallitsee yksi toisikseen muuttuvien kemiallisten muotojen pari, spektreillä voi olla yhteinen isosbestinen piste. Vesiliuossarjoissa se on havaittu kokeellisesti noin 625 nm:n kohdalla. Selkeä paikallaan pysyvä piste sopii tilanteeseen, jossa kaksi kemiallista muotoa hallitsee. Kun piste siirtyy tai katoaa pitoisuuden kasvaessa, pidä sitä varoituksena suurempien aggregaattien tai muuttuvien tasapainojen ilmaantumisesta, älä laitevirheenä.

Liuotin, pH ja lämpötila muuttavat spektriä

Vesi suosii assosiaatiota. Dimetyylisulfoksidin lisääminen vähentää dimerisoitumista, siirtää absorptio- ja fluoresenssimaksimeja pidemmille aallonpituuksille ja kasvattaa fluoresenssin kvanttisaantoa noin nelinkertaiseksi. Näin todetaan metyleenisinistä veden ja DMSO:n seoksissa käsittelevässä liuotintutkimuksessa, jonka tunniste on PMID 30933781. Tutkimuksessa vesiliuosten spektrejä tarkastellaan monomeerin ja dimeerin välisenä tasapainona: monomeerin absorbanssi sijoittuu noin 650–670 nm:n ja dimeerin absorbanssi noin 580–615 nm:n alueelle. Dimerisoitumisvakiot johdetaan spektreistä lämpötilassa 293.15 K.

Alkoholit muuttavat sekä sijaintia että näennäistä voimakkuutta, mutta eivät poista aggregoitumista. Yhdessä alkuperäisessä vertailututkimuksessa, joka tehtiin 31.3 mikromolaarisessa pitoisuudessa ja huoneenlämpötilassa ja raportoitiin metyleenisinisen liuotintutkimuksessa, pitkän aallonpituuden maksimi oli vedessä 665 nm mutta metanolissa 655 nm. Koko liuoksen näennäiset arvot olivat noin 37,100 vedessä ja 60,800 metanolissa. Erillisessä validoinnissa absoluuttisessa etanolissa lämpötilassa 298 K maksimi oli 655 nm ja epsilon noin 68,000.

Tavanomaiset pH:n muutokset siirtävät spektriä vähemmän kuin monissa menetelmäohjeissa oletetaan. Edellä mainitun kriittisen katsauksen mukaan maksimi pysyi lähellä 665 nm:ä noin pH:n 2 ja pH:n 12 välillä, ja voimakkuus muuttui vain vähän pH:hon 11 asti. Puskurin tyyppi ja ionivahvuus voivat vaikuttaa tuloksiin yhtä paljon kuin nimellinen pH, joten kirjaa käytetty puskuri ja suola, älä pelkästään pH-mittarin lukemaa. Vahvasti happamat tai vahvasti emäksiset olosuhteet ovat erillinen tapaus, sillä väriaineessa voi tapahtua kemiallinen muutos palautuvan assosiaation sijaan. Myös lämpötila ja suola muuttavat tasapainoa, minkä vuoksi vuoden 2020 vesitutkimuksessa molempia vaihdeltiin tarkoituksellisesti.

Mittaaminen niin, että lukuarvo pysyy pätevänä

Kvantitatiivinen työ perustuu Beer–Lambertin lakiin: absorbanssi on epsilonin, pitoisuuden ja optisen matkan tulo. Lisäksi on osoitettava, että lineaarinen alue todella pätee käytetyissä olosuhteissa.

Käytä 1 cm:n kyvettiä pienillä mikromolaarisilla pitoisuuksilla. Kun epsilon on noin 82,000, 5 mikromolaarinen pitoisuus tuottaa noin 0.41:n absorbanssin ja 10 mikromolaarinen pitoisuus noin 0.82:n absorbanssin. Kun pelkässä vedessä tehtävä mittaus kohdistuu monomeeriin, on turvallisempaa pysyä suunnilleen 5–7 mikromolaarisessa pitoisuudessa tai sen alapuolella kuin ulottaa kalibrointi kymmenien mikromolaarien pitoisuuksiin. Lyhennä optista matkaa väkeville kantaliuoksille sen sijaan, että hyväksyisit selvästi yli 1:n absorbanssin.

Käytä nollanäytteenä täsmälleen samaa matriisia: samaa vesilaatua, samaa rinnakkaisliuottimen osuutta sekä samaa puskuria ja samoja suoloja, mutta ilman väriainetta. Valmista kalibrointiliuokset samaan matriisiin ja samaan lämpötilaan. Mittaa menetelmän kehityksen aikana koko näkyvän valon alue, mieluiten noin 550–750 nm, sen sijaan että lukisit vain yhtä aallonpituutta. Seuraa muotoa, älä pelkästään korkeutta. Jos sarjalaimennus muuttaa normalisoitua muotoa, järjestelmän kemiallinen tila riippuu pitoisuudesta. Vakaa maksimi ja vakaa absorbanssisuhde aallonpituuksilla 610 ja 665 nm ovat vahvempaa näyttöä hyväksyttävästä alueesta kuin pelkkä suuri R:n neliö.

Dokumentoi reagenssin muoto. Kaupallinen materiaali voi olla vedetöntä metyylitioniniumkloridia tai hydraattia, kuten trihydraattia, joten kantaliuoslaskelmissa käytetyn moolimassan on vastattava pullon todellista sisältöä. Pelkästään tämä vaihe selittää osan laboratorioiden nimellisten molaaristen pitoisuuksien eroista. Samaa huolellisuutta tarvitaan, kun tuloksia käytetään kvantitatiivisten määritysten laskelmissa, kun spektrit tukevat formulaation stabiilisuuden tarkistuksia ja kun epäpuhtausprofiilit edellyttävät puhtauden ja spesifikaatioiden tarkastelua.

Yhteenveto mittausolosuhteineen

Käytä tätä taulukkoa laboratoriokirjauksen lähtöpohjana, älä keskenään vaihdettavien vakioiden lähteenä.

Metyleenisinisen absorbanssin aallonpituuteen on siis lyhyt vastaus, joka vaatii pitkän alaviitteen. Ilmoita mittaamasi huippu, käyttämäsi liuos ja mittauspitoisuus. Tämä käytäntö estää yhtä noin 664 nm:n kohdalla saatua laimean vesiliuoksen arvoa muuttumasta virheellisesti yleispäteväksi vakioksi.