Metyleenisininen ja ATP: tarkoittaako suurempi hapenkulutus enemmän energiaa?

Eristetty mitokondrio on mittauskammiossa, jossa on polttoainetta mutta ei ADP:tä. Se kuluttaa happea hitaasti. Kun ADP:tä lisätään, hapenkulutus kasvaa moninkertaiseksi. Kun ADP loppuu, hapenkulutus laskee takaisin. Polttoaine ei muuttunut missään vaiheessa. Vain ATP:n tarve muuttui.

Tämä lyhyt tapahtumaketju tiivistää koko eron, jota tässä artikkelissa käsitellään. Hapenkulutus mittaa sitä, kuinka nopeasti elektronit virtaavat hengitysketjun kautta hapelle. ATP:n tuotanto mittaa sitä, kuinka suuri osa tästä virrasta saadaan talteen käyttökelpoisena energiana. Niillä on yhteinen välivaihe: mitokondrion sisäkalvon yli muodostuva protonigradientti. Kaikki, mikä muuttaa gradientin ja ATP-synteesin välisen kytkennän tiukkuutta, voi muuttaa näitä kahta mittaustulosta eri suuntiin. Metyleenisininen on tässä hyödyllinen opettaja, sillä sen on havaittu tekevän molempia: joissakin valmisteissa se lisää hapenkulutusta yhdessä ATP:n kanssa, toisissa taas hapenkulutus lisääntyy ATP:n pysyessä ennallaan tai vähentyessä.

Lukijat, jotka haluavat ensin laajemman kuvan elektronien välityksestä, voivat aloittaa siitä, miten metyleenisininen siirtää elektroneja hengitysketjussa. Varhaisten hapenkulutuskokeiden sanastoon perehtyvät lukijat voivat puolestaan lukea, mitä ensimmäiset hengitysmittaukset todella osoittivat.

Hengitys, ATP ja niiden välinen gradientti

NADH:n ja FADH2:n elektronit tulevat ketjuun kompleksien I ja II kohdalla, kulkevat kompleksin III kautta sytokromi c:lle ja sitten kompleksin IV kautta hapelle. Komplekseissa I, III ja IV vapautuva energia pumppaa protoneja matriksista kalvojen väliseen tilaan. Tämä varauksen ja happamuuden eriytyminen muodostaa protonimotorisen voiman, jonka sähköinen osa, kalvopotentiaali, on yleensä hallitseva.

ATP-syntaasi päästää protonit virtaamaan takaisin matriksiin ja käyttää vapautuvaa energiaa ADP:n ja fosfaatin yhdistämiseen ATP:ksi. Ketju on siis seuraava:

hapenkulutus, sitten protonien pumppaus, sitten gradientti ja lopuksi ATP-synteesi.

Ongelma on siinä, että protonit voivat palata muitakin reittejä. Kaikki ATP-syntaasin ohittava paluu on protonivuotoa. Vuoto pakottaa ketjun pumppaamaan samat protonit uudelleen kalvopotentiaalin pitämiseksi vakaana. Tämä kuluttaa enemmän happea tuottamatta enemmän ATP:tä. Riittävän voimakas vuoto merkitsee kytkennän purkautumista: hapenkulutus lisääntyy ATP:n pysyessä ennallaan tai vähentyessä, ja hukkaan menevä energia vapautuu lämpönä.

Tila 3, tila 4 ja hengityksen kontrollisuhde

Tämän ilmiön klassinen sanasto on peräisin eristetyillä mitokondrioilla tehdyistä tutkimuksista. Tila 3 tarkoittaa hengitystä substraatin ja ADP:n läsnä ollessa: ATP-syntaasi purkaa gradienttia, kalvopotentiaali laskee hetkellisesti, ketju kiihtyy palauttaakseen sen, ja hapenkulutus on suurta, koska ATP:tä tuotetaan. Tila 4 tarkoittaa hengitystä ADP:n loputtua: ATP-syntaasi käy joutokäynnillä, gradientti kasvaa, korkea kalvopotentiaali vastustaa pumppaamista ja hapenkulutus laskee tasolle, joka tarvitaan vuodon korvaamiseen.

Hengityksen kontrollisuhde, eli tila 3 jaettuna tilalla 4, kertoo siten valmisteen kytkennän tiukkuudesta. Suuri suhde tarkoittaa, että ADP säätelee hengitystä voimakkaasti. Suhteen pieneneminen tilan 4 hengityksen lisääntyessä tarkoittaa, että vuoto alkaa hallita. Tämän näkökulman kautta jäljempänä esitetyt metyleenisinistä koskevat tulokset tulevat ymmärrettäviksi.

Yksi ajatusmalli kannattaa pitää mielessä. Korkea kalvopotentiaali hidastaa ketjua. Potentiaalin purkaminen nopeuttaa sitä. Ketju reagoi pumppaamisen vaikeuteen, ei suoraan siihen, tuotetaanko ATP:tä.

Kun mittaustulokset muuttuvat yhdessä

Selkein esimerkki säilyneestä kytkennästä saadaan eristetyistä marsun aivojen mitokondrioista, joiden hengitysketjun komplekseja oli estetty. Metyleenisinisen pitoisuuksilla 100 nanomolaarista 1 mikromolaariin lepohapenkulutus lisääntyi, kun polttoaineena käytettiin glutamaattia ja malaattia, sukkinaattia tai glyserofosfaattia, mutta ADP:n stimuloima hengitys pysyi ennallaan. Mitokondrioissa, joiden kompleksi I tai kompleksi III oli myrkytetty, väriaine lisäsi hieman ATP:n tuotantoa, palautti kalvopotentiaalia ja paransi kalsiumin ottoa. Ehdotettu reitti on oikotie: väriaine vastaanottaa elektroneja ennen estokohtaa ja luovuttaa ne sytokromi c:lle ohittaen vaurioituneen kompleksin.

Toinen esimerkki yhdessä muuttuvista tuloksista hyödyntää kokonaan eri ATP-lähdettä. Eristetyissä aivojen mitokondrioissa, joiden ATP-syntaasi oli estetty, metyleenisininen stimuloi edelleen hengitystä kaikilla testatuilla substraateilla. ATP-synteesi lisääntyi kuitenkin vain alfa-ketoglutaraatilla ja glutamaatilla, kahdella sukkinyyli-CoA:ta muodostavalla substraatilla. Kun oligomysiini esti ATP-syntaasin, ylimääräinen ATP syntyi sitruunahappokierron sukkinyyli-CoA-ligaasin toteuttamassa substraattitason fosforylaatiossa, ei oksidatiivisessa fosforylaatiossa. Väriaine palautti myös kalvopotentiaalia, kun kompleksi I ja ATP-syntaasi estettiin samanaikaisesti. Tässä hapenkulutus ja ATP muuttuivat yhdessä, mutta vain silloin, kun substraatti mahdollisti toisen ATP:n tuotantoreitin. Sukkinaatilla tai malaatilla hengitys lisääntyi ilman ylimääräistä ATP:tä. Sama väriaine, sama kammio, eri polttoaine, eri vastaus.

Kun mittaustulokset erkanevat

Myös erkanemistapaukset ovat julkaistuja ja yhtä opettavaisia. Vuonna 1997 julkaistussa eristettyjen rotan maksan mitokondrioiden tutkimuksessa metyleenisininen kiihdytti tilan 4 hengitystä tiukasti kytketyissä mitokondrioissa, jotka käyttivät sukkinaattia hengityssubstraattina. Tämä pienensi hengityksen kontrollisuhdetta. Vaikutus näkyi jo 0.5 mikromolaarin pitoisuudesta alkaen ja oli voimakas 5 mikromolaarin pitoisuudessa, joka on lähellä plasmapitoisuuksia 100 milligramman laskimonsisäisen boluksen jälkeen. Pitoisuudella 5 mikromolaaria mitokondriot myös turposivat, mutta kytkentähäiriö ilmeni ensin pienemmillä pitoisuuksilla. Tämä viittaa siihen, että vuoto edelsi rakenteellista vauriota eikä johtunut siitä. Mitokondrioissa, joiden kytkentä oli purettu, väriaine stimuloi hengitystä saturoituvalla, pitoisuudesta riippuvalla tavalla. Hapenkulutus lisääntyi molemmissa valmisteissa. ATP-synteesi kulutettua happea kohti ei lisääntynyt. Samassa molekyylissä yhdistyivät siis oppikirjaesimerkin tavoin kytkennän purkautuminen ja elektronien siirtäminen.

Selkein eriytyminen havaitaan verkkokalvossa. AIF-puutteisilla hiirillä ja rotenonilla käsitellyissä valoreseptorisoluissa metyleenisininen säilytti verkkokalvon paksuutta, valoreseptorien merkkiaineita ja mitokondrioiden rakennetta. Se myös pienensi NADH:n ja NAD:n suhdetta ja vaimensi stressireittejä, kuten laskostumattomien proteiinien vastetta ja mitofagiaa. Tämä tapahtui korjaamatta ATP-vajetta. Suojaava vaikutus ilman energiantuotannon palautumista tarkoittaa, että hyöty välittyi hapetus-pelkistystasapainon ja mitokondrioiden eheyden kautta, ei ylimääräisen ATP:n kautta. Kuka tahansa, joka rinnastaisi kudoksen säilymisen energiantuotannon palautumiseen, tulkitsisi kokeen täysin väärin.

Aivojen mitokondrioita koskeva tutkimus lisää samaan tilikirjaan myös kustannussarakkeen. Samat pienet pitoisuudet, jotka paransivat bioenergetiikkaa, lisäsivät myös vetyperoksidin muodostumista kaikissa testatuissa olosuhteissa ja hidastivat sen poistumista. Tämä mitattiin kalibroidulla Amplex-menetelmällä, ei epäspesifisellä väriaineella. Enemmän ATP:tä ja enemmän hapetinta tuli samassa paketissa.

Käytännön tarkistuslista tutkimusten lukemiseen

Neljä kysymystä erottaa kytkennän säilyttävän tuloksen kytkentää purkavasta tuloksesta.

Ensinnäkin: mitä vastemuuttujaa todella mitattiin? Pelkkä hapenkulutus ei kerro ATP:stä. ATP-synteesi, kalvopotentiaali ja hengityksen kontrollisuhde tuovat kukin tietoa, jota happielektrodi ei näe. Metyleenisinistä koskevien tutkimusväitteiden lukemisopas käsittelee yksityiskohtaisesti tätä vastemuuttujien huolellista tulkintaa.

Toiseksi: mikä substraatti ruokki mitokondrioita? Sukkinyyli-CoA:ta koskeva tulos osoittaa, että polttoaineen valinta voi ratkaista, voiko lisääntynyt hengitys ylipäätään tuottaa lisää ATP:tä.

Kolmanneksi: mitä pitoisuutta käytettiin? Nanomolaarisesta matalaan mikromolaariseen ulottuvat metyleenisinipitoisuudet tuottivat aivojen mitokondrioissa vaatimattomia bioenergeettisiä hyötyjä hapettimien lisääntymisen kustannuksella. Maksan mitokondrioissa puolen mikromolaarin ja sitä suuremmat pitoisuudet heikensivät kytkentää, ja 5 mikromolaaria aiheutti lisäksi turpoamista. Pitoisuus on osa mekanismia, ei taustatieto.

Neljänneksi: millä mallilla tulos saatiin? Eristetyt mitokondriot paljastavat kytkennät, mutta ehjät solut ja kudokset tuovat mukaan kuljetuksen, pelkistymisen värittömäksi muodoksi sekä elektronien kilpailevat vastaanottajat. Laboratorion annostelututkimukset, mukaan lukien se, miten pitoisuus ja koemenettely muovaavat metyleenisinisen vaikutuksia, muodostavat sillan mittauskammion lukemien ja kaikkien ihmistä koskevien väitteiden välille.

Hapenkulutus kertoo elektronivirrasta. ATP kertoo, kuinka suuri osa tästä virrasta saatiin talteen. Metyleenisininen voi muuttaa kumpaa tahansa, ja yllä olevat kokeet osoittavat kaikki neljä seuraavaa yhdistelmää: molemmat lisääntyvät, hengitys lisääntyy mutta ATP vain substraatin sen mahdollistaessa, hengitys lisääntyy kytkennän heikentyessä, ja kudos säilyy ATP:n pysyessä ennallaan. Happielektrodin lukema on tulkinnan alku, ei sen loppu.