Metyleenisininen ja Bartonella: laboratoriotulokset ja kliinisen näytön rajat

Viljelymaljaa ja potilasta yhdistää sana infektio, mutta ei sama käsite. Maljalla infektio tarkoittaa agarilla kasvavien pesäkkeiden määrää. Potilaassa se tarkoittaa bakteereja solujen ja verisuonten sisällä, veren ja kudosten kautta kulkevia lääkkeitä sekä immuunijärjestelmää, joka tekee osan työstä. Jos nämä sekoittaa toisiinsa, vaikuttava laboratorioluku alkaa näyttää hoidolta. Kun ne pitää erillään, sama luku on sitä, mitä se on: peruste seuraavalle kokeelle.

Tämän metyleenisinistä ja Bartonellaa käsittelevän katsauksen koko tehtävä on pitää nämä asiat erillään. Saman tutkimusryhmän kaksi laboratoriotutkimusta testasi metyleenisinistä kasvamattomassa tilassa olevia Bartonella henselae -bakteereja vastaan. Molemmissa raportoitiin voimakasta aktiivisuutta lasi- ja muoviastioissa. Kummassakaan ei tutkittu ihmisiä.

Miksi tutkijat testaavat stationaarivaihetta

Useimmissa antibioottitesteissä käytetään kasvavia soluja. Tämä malli sivuuttaa vaikeamman tapauksen: solut, jotka ovat lakanneet jakautumasta ja sietävät lääkkeitä, jotka tappavat niiden kasvavat sisarsolut.

Bartonella voi säilyä elimistössä, myös punasolujen ja endoteelisolujen sisällä. Siksi tutkimusryhmä selvitti, mitkä hyväksytyt lääkkeet voivat tappaa B. henselae -bakteereja niiden siirryttyä stationaarivaiheeseen. Pieni MIC-arvo kasvavia soluja vastaan ei ennustanut stationaarivaiheen solujen tappamista. Rifampisiinin MIC-arvo oli hyvin pieni, mutta se tappoi stationaarivaiheen soluja heikosti. Suuremman MIC-arvon yhdisteet puolestaan tappoivat niitä hyvin. Yleisen menetelmän tällaisten artikkelien arviointiin löytää metyleenisinistä koskevan tutkimuksen lukuoppaasta.

Ensimmäinen seulonta: Li ja kollegat, 2019

Antibiotics-lehdessä julkaistussa vuoden 2019 stationaarivaiheen seulonnassa käytettiin yhtä kantaa, B. henselae JK53:a. Sitä kasvatettiin Schneider-kasvatusalustassa, jossa oli 10 prosenttia naudan sikiöseerumia, lämpötilassa 37 C ja 5 prosentin CO2-pitoisuudessa. Yhden päivän ikäiset viljelmät koostuivat enimmäkseen erillään olevista jakautuvista soluista. Viiden päivän ikäiset viljelmät, joissa oli noin 10 potenssiin 8 pesäkkeen muodostavaa yksikköä per mL, katsottiin stationaarivaiheen viljelmiksi, ja niissä oli näkyviä aggregaatteja.

Määrityksessä käytettiin SYBR Green I -väriainetta ja propidiumjodidia. Menetelmä kalibroitiin elävien ja isopropanolilla tapettujen solujen seoksilla. Koska metyleenisininen on voimakkaasti värillistä, seulonnan osumat varmistettiin mikroskopialla ja sen jälkeen veriagarin pesäkelaskennalla, joka on tiukempi päätemuuttuja.

Kun 1,581 hyväksyttyä lääkettä testattiin 50 mikromolaarin pitoisuudessa, metyleenisinisen jälkeen elinkelpoisuus oli mikrolevylukijalla mitattuna 16 prosenttia ja mikroskopialla 25 prosenttia. Daptomysiinin tulos oli 21 prosenttia, useiden atsolien 22–27 prosenttia, gentamisiinin 32 prosenttia, erytromysiinin 66 prosenttia ja siprofloksasiinin 74 prosenttia. Pyrviinipamoaatti näytti lukijalla tehokkaammalta, mutta sitä ei voitu arvioida mikroskopialla sen oman fluoresenssin vuoksi.

Kasvavia B. henselae -bakteereja vastaan metyleenisinisen MIC oli 0.08–0.16 mikrogrammaa per mL. Kun viiden päivän ikäiset stationaarivaiheen solut altistettiin pitoisuudelle 5 mikrogrammaa per mL, havaittavia pesäkkeitä ei ollut enää yhden päivän altistuksen jälkeen. Tulos vastasi daptomysiinin ja pyrviinipamoaatin tuloksia niiden testatuilla pitoisuuksilla. Erillisessä tappokinetiikkakokeessa käytettiin pitoisuutta 10 mikrogrammaa per mL. Nämä ovat laboratorioaltistuksen pitoisuuksia, eivät annoksia, ja artikkelissa ne esitetään sellaisina. Artikkelissa mainittu ihmisellä mitattu plasman huippupitoisuus, noin 3.9 mikrogrammaa per mL, esiintyy vain taustatietona. Metyleenisinisen farmakokinetiikan yleiskatsaus selittää, miksi plasmapitoisuutta ei voi tulkita kudospitoisuudeksi.

Artikkelissa tuodaan selvästi esiin kaksi rajoitusta. Tutkimuksessa ei ollut biofilmimallia eikä metyleenisinisen yhdistelmätestejä. Viiden päivän ikäiset aggregaatit olivat stationaarivaiheen nesteviljelmän soluryppäitä, eivät validoitu biofilmikoe. Kirjoittajat peräänkuuluttivat eläinkokeita, yhdistelmätutkimuksia, biofilmitutkimuksia ja testejä muilla Bartonella-lajeilla.

Yhdistelmät ja biofilmistä peräisin olevat solut: Zheng ja kollegat, 2020

BMC Microbiology -lehdessä julkaistussa vuoden 2020 jatkotutkimuksessa käytettiin samaa kantaa ja kasvatusalustaa, mutta siirryttiin kuuden päivän ikäisiin stationaarivaiheen viljelmiin. Lisäksi mukaan otettiin kaksi ensimmäisestä tutkimuksesta puuttunutta asiaa: kahden lääkkeen yhdistelmät ja biofilmistä peräisin olevien solujen malli.

Yksittäisiä lääkkeitä testattiin samalla pitoisuudella, 5 mikrogrammaa per mL, 24 tunnin ajan. Metyleenisinisen jälkeen jäljellä oli 3.2 kertaa 10 potenssiin 4 pesäkkeen muodostavaa yksikköä per mL, kun verrokissa niitä oli noin 2.8 kertaa 10 potenssiin 10. Siprofloksasiinin, gentamisiinin ja nitrofurantoiinin jälkeen pesäkkeitä oli samassa vaiheessa vähemmän. Tämä poikkeaa vuoden 2019 tuloksesta, jossa samalla nimellispitoisuudella ei saatu havaittavia pesäkkeitä yhden päivän jälkeen. Viljelmien ikä, tiheys ja käsittely erosivat toisistaan, joten tappovaikutus toistui samansuuntaisena mutta ei saman suuruisena. Tämä kokeiden välinen vaihtelu on yksi syy siihen, miksi tavanomaisissa turvallisuuden ja yhteisvaikutusten arvioinneissa laboratoriossa havaittu teho erotetaan kliinisestä vaikutuksesta.

Yhdistelmäseulonta on tutkimuksen useimmin siteerattu osa. Jokaisen aineen pitoisuus oli vakioitu tasolle 5 mikrogrammaa per mL. Sekä atsitromysiinin ja metyleenisinisen että rifampisiinin ja metyleenisinisen yhdistelmän jälkeen havaittavia stationaarivaiheen pesäkkeitä ei ollut 24 tunnin kohdalla. Sama tulos saatiin molemmilla siprofloksasiiniyhdistelmillä, ja vain näillä neljällä yhdistelmällä 25 testatun parin joukosta. Muodollista synergia-analyysiä ei tehty, joten oikea termi on näissä olosuhteissa aktiivinen yhdistelmä, ei osoitettu synergia.

Biofilmikokeessa testattiin nuoresta, hajotetusta biofilmistä kerättyjä soluja, ei aineiden tunkeutumista ehjään, kypsään biofilmiin. Viljelmiä kasvatettiin viisi päivää, laimennettiin kuoppalevyille vielä viideksi päiväksi, varmistettiin kristalliviolettivärjäyksellä ja kaavittiin sitten irti ennen lääkealtistusta. Pitoisuudella 5 mikrogrammaa per mL pelkkä metyleenisininen laski määrän tasolle 2.3 kertaa 10 potenssiin 2 päivään 6 mennessä. Se oli yksittäisistä aineista parhaiden joukossa, mutta tulos ei ollut nolla. Molemmat metyleenisinisen yhdistelmät saavuttivat nollan päivään 6 mennessä, samoin molemmat siprofloksasiinin yhdistelmät.

Kirjoittajat nostivat esiin samat rajoitukset, jotka huolellinen lukija huomaisi: nuori, irti kaavittu biofilmi vanhan ja ehjän biofilmin sijaan; yksi käytännöllinen pitoisuus kaikille lääkkeille kunkin lääkkeen oman realistisen huippupitoisuuden sijaan; vain valitut atsitromysiiniin tai rifampisiiniin perustuvat yhdistelmät; yksi kanta; ei eläimiä eikä potilaita. Myöhempiä kolmen lääkkeen tutkimuksia ehdotettiin, mutta niitä ei raportoitu.

Tutkimusasetelmien vertailu

Taulukko esittää tämän artikkelin ydinasian tiiviisti. Kaikki viimeisen sarakkeen vasemmalla puolella on viljelytutkimusta. Kummassakaan artikkelissa ei ole mitään viimeiseen sarakkeeseen kuuluvaa.

Bartonella ei ole Borrelia

Molemmissa artikkeleissa mainitaan Borrelia burgdorferi, Lymen tautia aiheuttava spirokeetta, koska väriainemääritys oli peräisin saman laboratorion aiemmista Borrelian stationaarivaiheen tutkimuksista. Niissä myös metyleenisininen ja daptomysiini olivat osoittautuneet seulonnan osumiksi. Tämä tausta on hyödyllinen, mutta myös yleinen virheiden lähde.

Kummankaan Bartonella-artikkelin kokeissa ei testata Borreliaa ja Bartonellaa rinnakkain. Organismit, kasvatusalustat ja pitoisuudet eroavat toisistaan. Metyleenisinisen oletettu vaikutus Bartonellan solukalvoon esitettiin arviona, joka vaatii lisätutkimuksia. Tuloksia ei pidä siirtää lajista toiseen, eikä kumpikaan artikkeli tue laajoja väitteitä loisista. Borrelian ja Bartonellan persisterisolujen vertailu pitää näitä koskevat tutkimuskirjallisuudet erillään juuri tästä syystä.

Miksi viljelytuloksista ei synny hoitoprotokollaa

Kiinnostus metyleenisinisen Bartonella-hoitoprotokollan etsimiseen on ymmärrettävää. Juuri näiden artikkelien vuoksi tätä ilmausta pitäisi kuitenkin pitää varoitusmerkkinä eikä ostoslistana.

Ensinnäkään 5 mikrogrammaa per mL viljelykuopassa ei ole lääkemääräys. Siihen ei liity tietoa imeytymisestä, jakautumisesta, proteiineihin sitoutumisesta, solunsisäisestä kulkeutumisesta tai siedettävyydestä. Kirjoittajat valitsivat pitoisuuden antibioottien huippupitoisuuksien karkeaksi keskiarvoksi ja totesivat, että jatkotutkimuksissa tulisi käyttää kullekin lääkkeelle omaa realistista pitoisuutta.

Toiseksi nolla pesäkettä tarkoittaa, ettei pesäkkeitä havaittu kyseisissä maljaviljelyn olosuhteissa, ei sitä, että kudos olisi steriili. Persisterisolut, solunsisäiset bakteerit ja näytteenoton rajoitukset jäävät kaikki agarmaljan ulkopuolelle.

Kolmanneksi yhdistelmät, jotka steriloivat viljelykuopan, voivat olla elimistössä tehottomia tai haitallisia. Atsitromysiinin ja metyleenisinisen sekä rifampisiinin ja metyleenisinisen yhdistelmät ovat laboratoriossa käytettyjä pareja laboratorioaltistuksilla. Ilman eläinten farmakokineettisiä tutkimuksia ja kontrolloitua ihmisistä saatua tutkimustietoa ei ole määritetty annosta, kestoa eikä hyöty-riskisuhdetta. Vaihtoehtoja harkitsevan tulisi keskustella niistä lääkärin kanssa ja perehtyä siihen, milloin metyleenisinisen käyttö edellyttää lääketieteellistä valvontaa, ennen kuin tekee johtopäätöksiä maljoilta saaduista tiedoista.

Näiden artikkelien tukema rajattu johtopäätös on tämä: metyleenisinisellä on toistettavaa aktiivisuutta kasvamattomia B. henselae JK53 -bakteereja vastaan in vitro, myös kahden lääkkeen laboratorioyhdistelmissä. Vahvimmat yhdistelmiä ja biofilmistä peräisin olevia soluja koskevat tulokset saatiin vuoden 2020 tutkimuksessa. Kaikki muu, myös se, onko tällä aktiivisuudella merkitystä ihmisen bartonelloosissa, on edelleen testaamatta.