Metyleenisininen aivohalvauksen ja aivojen hypoperfuusion tutkimuksessa: mitä kolme mallia todella osoittavat

Tukkeutunut valtimo, ravintoaineiden puutteesta kärsivä soluviljelmä ja rotta, jonka kaulavaltimot ovat ahtautuneet, kuulostavat saman kokeen kolmelta versiolta. Ne eivät ole sitä. Jokainen vastaa eri kysymykseen, ja metyleenisininen antaa kussakin erilaisen vastauksen. Jos ne sekoittaa keskenään, tutkimuskirjallisuus näyttää ristiriitaiselta. Kun ne erottaa toisistaan, esiin tulee selkeä kuvio, jota määrää ennen kaikkea ajoitus.

Tämä erottelu on koko katsauksen ydin. Kolme mallia ovat akuutti paikallinen aivohalvaus, hapen ja glukoosin puute ja sitä seuraava hapensaannin palauttaminen viljellyissä soluissa sekä viikkoja kestävä aivojen krooninen hypoperfuusio. Niitä yhdistäväksi ehdotettu mekanismi liittyy mitokondrioihin, mutta tulokset eroavat, koska aineenvaihdunnan olosuhteet eroavat.

Kolme mallia vastaavat eri kysymyksiin

Akuutti paikallinen aivohalvaus tuotetaan rotilla yleensä tukkimalla keskimmäinen aivovaltimo. Menetelmän lyhenne on MCAO. Verihyytymän kaltainen tukos synnyttää iskeemisen ydinalueen, jota ympäröi penumbra eli vaarantunut mutta mahdollisesti pelastettavissa oleva kudos, jos verenvirtaus palautuu. Tässä kysytään, hidastaako interventio infarktialueen kasvua tai säilyttääkö se toimintakykyä verenvirtauksen palautumisen eli reperfuusion yhteydessä.

Hapen ja glukoosin puute, lyhenteeltään OGD, tarkastelee ilmiötä aivan toisessa mittakaavassa. Viljellyt aivosolut siirretään lähes hapettomiin olosuhteisiin ilman glukoosia ja palautetaan sitten normaaliin kasvatusliuokseen. Mukana ei ole verihyytymää, kollateraaliverenkiertoa, verenpainetta eikä immuunijärjestelmää. Kysymys koskee yksinomaan soluja: mitä soluhengitykselle, ATP:lle ja eloonjäämiselle tapahtuu, kun substraatit katoavat ja sitten palaavat.

Aivojen kroonisen hypoperfuusion tutkimuksessa käytetään rottien molempien kaulavaltimoiden pysyvää sulkemista, jota kutsutaan 2VO-malliksi. Verenvirtaus etuaivoihin vähenee ja pysyy vähäisenä viikkoja. Mallissa ei synny äkillistä paikallista infarktia eikä tehdä kiireellistä reperfuusiota. Kysymys on siitä, säilyttääkö viikkoja jatkuva aineenvaihdunnan tukeminen verisuonia, mitokondrioita ja muistia pitkittyneen heikon verenvirtauksen aikana.

Muistin paraneminen kuukauden hoidon jälkeen 2VO-mallissa ei siis kerro suoraan mitään ihmisen aivojen pelastamisesta kiireellisen trombektomian aikana. Erottelu on tärkeä, koska useimmat optimistiset yhteenvedot sivuuttavat sen.

Akuutti aivohalvaus: suojaa reperfuusion yhteydessä, viivettä ilman sitä

Selkein akuutin tilanteen tulos saatiin ohimenevässä MCAO-mallissa, johon liittyi reperfuusio. Rottien valtimo oli tukittuna 60 minuuttia, minkä jälkeen niille annettiin pieni annos metyleenisinistä laskimoon reperfuusion alkaessa. Lisäannokset annettiin 3 tunnin kohdalla ja päivänä 2. Magneettikuvaus osoitti, että pelkkää kantajaliuosta saaneen ryhmän vaurioalue kasvoi noin 19 prosenttia päivään 2 mennessä, kun taas hoidetun ryhmän vaurioalue pieneni noin 17 prosenttia. Lopulliset infarktialueet olivat noin 30 prosenttia pienempiä, ja neurologiset pisteet olivat paremmat päivinä 2 ja 7. Kuvantamisen perusteella sekä ydinalueen että penumbran kudosta säilyi enemmän. Laajempi hermokudoksen suojausta käsittelevä tutkimuskirjallisuus tarkastelee tätä reperfuusioon ajoittuvaa suojaa yhdessä globaalia iskemiaa ja vammoja koskevien löydösten kanssa.

Kuva muuttuu, kun valtimo pysyy tukossa. Pysyvää MCAO:ta käyttäneessä kokeessa jatkuvan iskemian aikana annettu metyleenisininen hidasti diffuusiokuvauksessa näkyvän vaurioalueen laajenemista ja pidensi hetkellisesti perfuusio- ja diffuusiolöydösten välistä epäsuhtaa. Paikallinen verenvirtaus oli hieman parempi, mutta lopullinen infarktitilavuus 24 tunnin kohdalla ei eronnut merkitsevästi. Se viivästytti vaarantuneen kudoksen muuttumista infarktiksi, mutta ei korvannut verisuonen avaamista.

Kolmas akuutin tilanteen tutkimus tarkentaa mekanismia ja annoksen merkitystä. Heti tukoksen muodostamisen jälkeen annettu yksittäinen vatsaontelonsisäinen annos pienensi infarktia eniten, noin 50 prosenttia, keskisuurella 5 mg/kg annoksella eikä 1 tai 10 mg/kg annoksella. Myös sensorimotoriset pisteet olivat paremmat. Tutkijat liittivät tämän mitokondrioiden rakenteen säilymiseen ja lisääntyneeseen mitofagiaan eli vaurioituneiden mitokondrioiden valikoivaan poistamiseen. Annoksella, antoreitillä ja ajoituksella on siis merkitystä, eivätkä rottien mg/kg-arvot ole ihmisille tarkoitettuja aivohalvausannoksia.

Soluviljelmä: sama lääke auttaa tai haittaa sen mukaan, milloin se annetaan

Astrosyyttikoe on havainnollisin ja myös useimmin väärin siteerattu. Hiiren aivokuoresta peräisin olevat primaariset astrosyytit altistettiin 6 tunniksi vaikealle puutostilalle: happea oli 0.1 prosenttia, eikä kasvatusliuoksessa ollut glukoosia, pyruvaattia tai seerumia. Tätä seurasi 24 tunnin jakso, jolloin hapensaanti ja substraattien saatavuus palautettiin. Noin puolet soluista kuoli, joten koeasetelmassa oli tilaa havaita vaikutuksia kumpaankin suuntaan.

Kun metyleenisinistä oli läsnä puutosvaiheen aikana, solujen eloonjääminen heikkeni eikä parantunut. Kun se lisättiin vasta hapensaannin palauttamisen yhteydessä, pienet mikromolaariset pitoisuudet paransivat elinkykyä ja lisäsivät hapenkulutusta, glukoosin ottoa ja ATP:n tuotantoa. Normaaliolosuhteissa samat pitoisuudet lisäsivät glukoosin ottoa noin 89 prosenttia 0.1 mikromolaarin pitoisuudella ja noin 200 prosenttia 1 mikromolaarin pitoisuudella. Vaurion jälkeen glykogeeni ja heksokinaasin aktiivisuus säilyivät, eikä superoksidin määrässä havaittu kasvua.

Mekanismia on helpompi ymmärtää vertaamalla sitä varavoimageneraattoriin. Metyleenisininen toimii vaihtoehtoisena elektroninkuljettajana, joka vastaanottaa pelkistysekvivalentteja ja välittää ne kohti sytokromi c:tä ja kompleksia IV. Tämä tukee elektronien kulkua ja ATP:n synteesiä sekä vähentää elektronivuotoa siirtoketjun aiemmissa vaiheissa. Vaikean puutostilan aikana tällainen tehostuminen on haitaksi, koska se lisää aineenvaihdunnan tarvetta tilanteessa, jossa happea ja glukoosia ei juuri ole. Viimeiset varannot voivat siksi ehtyä nopeammin. Kun substraatit palaavat, sama ominaisuus muuttuu hyödyksi, koska se auttaa vaurioituneita mitokondrioita käyttämään jälleen saatavilla olevaa happea ja glukoosia tehokkaasti. Siksi myös mitokondrioiden elektroninsiirtoa käsittelevien selitysten löydöksiin on liitettävä tieto puutostilan olosuhteista.

Yksi varaus: tämä ajoitusta koskeva sääntö pätee kyseiseen astrosyyttivalmisteeseen. Rinnakkaisessa solututkimuksessa käytettiin eri solutyyppiä, lievempää puutostilaa ja pienempää pitoisuutta. Siinä havaittiin suojaa myös silloin, kun altistus tapahtui puutosvaiheen aikana. Solutyyppi, jäljellä olevan hapen määrä, pitoisuus ja koemenetelmä ratkaisevat vaikutuksen suunnan.

Kroonisesti heikentynyt verenvirtaus: muisti, sytokromioksidaasi ja verisuonet viikkojen aikana

Kroonisissa kokeissa käytettiin päivittäistä pieniannoksista hoitoa viikkojen ajan, ei yksittäistä kiireellisesti annettua bolusta. Ensimmäisessä tutkimuksessa rotat, joiden kaulavaltimot oli suljettu pysyvästi, saivat 4 mg/kg päivittäin kuukauden ajan. Annos annettiin jokaisen päivittäisen harjoituskerran jälkeen, jotta vaikutus kohdistuisi muistin lujittumiseen eikä välittömään suoriutumiseen. Eläimet, joiden valtimot oli suljettu, oppivat visuaalisia erottelutehtäviä hitaammin ja suoriutuivat heikommin vaikeasta muistitestistä. Uimakyky, motorinen aktiivisuus ja hajujen tunnistaminen eivät kuitenkaan muuttuneet. Päivittäinen hoito lievensi oppimisen ja muistin heikkenemistä muuttamatta yleistä motorista käyttäytymistä.

Jatkotutkimuksessa kartoitettiin sytokromioksidaasia eli mitokondrioiden kompleksia IV yhteensä 44 aivoalueella saman kuukauden mittaisen hoitojakson jälkeen. Valtimoiden sulkeminen vähensi entsyymin aktiivisuutta näköaivokuorella, etuotsalohkon ja peririnaalisella aivokuorella sekä hippokampuksessa ja mantelitumakkeessa. Se myös heikensi näköaivokuoren ja hippokampuksen aktiivisuuden yhteisvaihtelua. Hoito säilytti alueellista entsyymiaktiivisuutta ja vahvisti näitä alueiden välisiä aineenvaihdunnallisia korrelaatioita, ja säilynyt aktiivisuus korreloi paremman tehtävistä suoriutumisen kanssa. Nämä korrelaatiot kuvaavat aineenvaihduntaentsyymin aktiivisuuden yhteisvaihtelua, eivät suoria mittauksia ihmisen aivojen toiminnallisesta kytkeytyneisyydestä. Aivojen energia-aineenvaihduntaa käsittelevät katsaukset auttavat pitämään tämän eron selkeänä.

Erillisessä viikon mittaisessa tutkimuksessa käytettiin 2 mg/kg päivittäin ja mekanismia tutkittiin lisäämällä mukaan signalointireitin estäjä. Hoidon myötä aivojen verenvirtaus kasvoi noin 60:stä noin 100 mL:aan 100 g:aa kohden minuutissa, ja hippokampuksen verisuonitiheys kasvoi noin 15.1 prosentista 23 prosenttiin. Molemmat muutokset kumoutuivat osittain, kun solujen eloonjäämistä tukeva PI3K/Akt-reitti estettiin, ja fosforyloidun Akt:n määrä kasvoi hoidon myötä. Verenvirtausta, verisuonitiheyttä, veri-aivoestettä ja hermosoluja koskevat löydökset viittaavat PI3K/Akt-signalointiin liittyvään hermokudoksen ja verisuonten suojaukseen eivätkä pelkkään aineenvaihdunnalliseen vaikutukseen.

Miksi mikään tästä ei vastaa aivohalvauksen päivystyshoitoa

Laboratorion hallitut olosuhteet ovat syy siihen, etteivät nämä tulokset siirry suoraan kliiniseen käyttöön. Viljellyissä soluissa ei ole veritulppaa eikä elimistötason farmakokinetiikkaa. 2VO-malli kuvaa pitkittynyttä, laaja-alaisesti heikentynyttä verenvirtausta, ei äkillistä paikallista embolusta ja vain minuutteja vanhaa penumbraa. Myös rottien MCAO-mallissa käytetään nuoria terveitä eläimiä, anestesiaa, yhdenmukaisia tukoksia ja tarkasti ajoitettua annostelua. Tilanne poikkeaa iäkkäistä potilaista, joilla on erilaisia hyytymiä, ateroskleroosia, verenpainetautia, diabetesta ja tuntematon oireiden alkamisaika.

Yksikään julkaistu satunnaistettu ihmistutkimus ei ole osoittanut metyleenisinistä akuutin iskeemisen aivohalvauksen päivystyshoidoksi. Toisinaan siteerattuun ihmisten kuvantamistutkimukseen osallistui 26 tervettä aikuista, ei aivohalvauspotilaita. Yksittäinen suun kautta annettu annos muutti tehtävään liittyviä aivosignaaleja ja paransi hieman mieleen palauttamista. Tämä osoittaa vaikutusta keskushermostossa, ei tehoa aivohalvauksessa. Nykyiset päivystyshoitosuositukset keskittyvät sen sijaan nopeaan reperfuusioon: laskimonsisäiseen trombolyysiin soveltuville potilaille ja trombektomiaan soveltuvissa suurten suonten tukoksissa. Vakiintuneet aivohalvauksen päivystyshoidon hoitopolut ovat edelleen ainoa osoitetusti toimiva lähestymistapa. Epäillyn aivohalvauksen hoitoa ei koskaan pidä viivästyttää metyleenisinisen antamiseksi. Prekliinisen annostelun ekstrapoloinnin käytännön rajoitukset selittävät, miksi rottien annosteluohjelmia ei voi tulkita kliinisiksi hoito-ohjelmiksi.

Turvallisuuteen liittyvät seikat vahvistavat tätä rajaa. Laskimonsisäisen metyleenisinisen tuotetiedoissa on kehystetty varoitus vakavasta tai kuolemaan johtavasta serotoniinioireyhtymästä, kun sitä käytetään yhdessä serotonergisten lääkkeiden kanssa. Näihin kuuluvat SSRI- ja SNRI-lääkkeet sekä MAO:n estäjät, joita monet aivohalvauksille alttiissa iässä olevat potilaat käyttävät. Metyleenisininen on vasta-aiheinen G6PD-puutoksessa hemolyysiriskin vuoksi. Se myös estää typpioksidisignalointia, mikä joissakin olosuhteissa lisää verisuonivastusta ja verenpainetta. Siksi sitä ei pidä kuvata yksinkertaisesti aivojen verenvirtausta lisääväksi lääkkeeksi. Hankinnaisen methemoglobinemian hoitoon hyväksytty laskimonsisäinen 1 mg/kg annostelu ei ole aivohalvauksen hoito-ohjelma.

Rehellinen yhteenveto on rajallinen mutta todellinen. Ohimenevän paikallisen iskemian reperfuusion yhteydessä pieniannoksinen metyleenisininen vähensi vaurion etenemistä rotilla. Pysyvän tukoksen aikana se viivästytti infarktia mutta ei estänyt sitä. Astrosyyteissä se oli haitallinen vaikean puutostilan aikana ja hyödyllinen hapensaannin palautuessa. Kroonisen hypoperfuusion aikana se säilytti sytokromioksidaasia, verisuonia ja muistia viikkojen ajan. Yksi elektroninkuljettaja, kolme olosuhdetta, kolme vastausta.