EMB-agar ja MacConkey-agar: kasvualustan valinta ja tulkinta

Opiskelija siirrostaa saman vesinäytteen kahdelle maljalle. Toiselle muodostuu tummia pesäkkeitä, joissa näkyy vihreä metallinhohto. Toiselle muodostuu kirkkaan vaaleanpunaisia pesäkkeitä, joita ympäröi samea kehä. Molemmat maljat siirrostettiin samasta putkesta, inkuboitiin vierekkäin ja luettiin samalla tunnilla. Opiskelija kysyy, kumpi malja on oikeassa.

Molemmat maljat ovat oikeassa. Ne vastaavat eri kysymyksiin. Sekaannus syntyy, kun näitä kahta kasvualustaa pidetään keskenään vaihdettavina suolistobakteerien seulontamenetelminä. Niillä on yhteinen tarkoitus: valikoida gramnegatiivisia enteerisiä organismeja ja erottaa laktoosia fermentoivat organismit fermentoimattomista. Ne kuitenkin toteuttavat tämän tarkoituksen erilaisella kemialla ja erilaisella visuaalisella logiikalla. Kun ymmärtää nämä kaksi perusperiaatetta, kasvualustan valinnasta ja pesäkkeiden tulkinnasta tulee rutiinia.

Lyhyt vastaus

EMB-agar käyttää kahta väriainetta, eosiini Y:tä ja metyleenisinistä, joilla on kaksi tehtävää: ne estävät grampositiivisten organismien kasvua ja saostuvat voimakkaasti happoa tuottavien organismien ympärille muodostaen tummia pesäkkeitä, joista Escherichia colille on klassisesti ominaista metallinvihreä hohde. MacConkey-agar jakaa tehtävät eri aineosille: sappisuolat ja kristallivioletti estävät grampositiivisia organismeja, laktoosi toimii fermentaatiosubstraattina ja neutraalipunainen ilmaisee hapon muodostumisen vaaleanpunaisina tai punaisina pesäkkeinä. Jos tavoitteena on havainnollinen presumptiivinen E. colin osoittaminen, EMB on käyttökelpoinen valinta. Jos tavoitteena on erottaa laktoosia fermentoivat organismit fermentoimattomista selkeästi vaaleanpunaisiin ja värittömiin, erityisesti uloste- tai virtsanäytteiden työnkuluissa, MacConkey on yleensä helpompi tulkita. Kumpikaan malja ei yksinään tunnista organismia värin perusteella.

EMB: väriaineet sekä valikoivat että ilmaisevat

EMB:n periaatteessa selektio ja indikointi perustuvat samoihin molekyyleihin. ASM:n eosiini-metyleenisinisen agarprotokolla kuvaa EMB:n sekä selektiiviseksi että differentiaaliseksi kasvualustaksi: väriainepari estää monien grampositiivisten organismien kasvua, kun taas laktoosin fermentaatio edistää väriaineiden sitoutumista ja saostumista. Levine-standardiformulaatio sisältää peptonia, laktoosia, fosfaattia, eosiini Y:tä, metyleenisinistä ja agaria, kuten FDA:n BAM-menetelmä Levine EMB -agarille luettelee. Huomaa, että vanhemmissa EMB-resepteissä laktoosin lisäksi käytettiin joskus sakkaroosia, kun taas Levine EMB sisältää laktoosia ilman sakkaroosia. Siksi on tärkeää kirjata, mitä formulaatiota laboratoriossasi käytetään.

EMB:n tulkinta tarkoittaa väriaineiden käyttäytymisen tulkintaa. Voimakas laktoosin fermentaatio tuottaa riittävästi happoa aiheuttamaan runsaan väriaineiden saostumisen, jolloin E. colin pesäkkeisiin muodostuu tummansiniset tai mustat keskustat ja klassisessa tapauksessa heijastuvassa valossa vihreä metallinhohto. Heikommin fermentoivat organismit, kuten Enterobacter ja Klebsiella, kasvavat tyypillisesti vaaleanpunaisina tai purppuranvärisinä limaisina pesäkkeinä ilman tätä hohdetta. Fermentoimattomat organismit, kuten Salmonella, Shigella ja Proteus, kasvavat yleensä värittöminä tai läpikuultavina pesäkkeinä, koska ne eivät tuota väriaineet saostavaa voimakasta happamuusmuutosta. Grampositiivisten organismien kasvu yleensä estyy, mutta estovaikutuksen voimakkuus vaihtelee kannan ja tuotteen mukaan. Väriaineiden valmistuksen yksityiskohtainen kemia, mukaan lukien syy siihen, miksi metyleenisininen käyttäytyy alun perin kationisena väriaineena, kuuluu erilliseen keskusteluun väriaineformulaatioista, ja mikroskopian yleinen tausta käsitellään värjäysmenetelmien atlaksessa. Tässä artikkelissa keskitytään maljojen valintaan ja tulkintaan.

Yllä oleva kuva on havainnollistava. Se näyttää odotettavan visuaalisen logiikan: EMB:llä tummia hohtavia pesäkkeitä, vaaleanpunaisia limaisia pesäketyyppejä ja vaaleita pesäketyyppejä, kun taas MacConkeylla jako on vaaleanpunaisiin ja vaaleisiin pesäketyyppeihin. Käytä kuvaa kuvion oppimiseen ja varmista sen jälkeen jokainen tulkinta valokuvatuilla kontrolliviljelmillä ja juuri työpisteessäsi käytettävän kasvualustan tuoteselosteella.

MacConkey: erilliset tehtävät, yksinkertaisempi visuaalinen sääntö

MacConkeyn periaatteessa kukin tehtävä annetaan eri aineosalle. ASM:n MacConkey-agarprotokolla käyttää samaa selektiivisen ja differentiaalisen kasvualustan määritelmää, ja FDA:n BAM-menetelmä MacConkey-agarille luettelee toiminnalliset aineosat: peptonit, laktoosin, sappisuolat, suolan, neutraalipunaisen, kristallivioletin ja agarin. Sappisuolat ja kristallivioletti yhdessä estävät grampositiivisten organismien kasvua. Laktoosi toimii fermentaatiosubstraattina. Neutraalipunainen toimii pH-indikaattorina ja muuttuu vaaleanpunaiseksi tai punaiseksi siellä, missä muodostuu happoa; voimakkaasti fermentoivien organismien ympärille voi lisäksi saostua sappia.

Tulkintasääntö on tarkoituksella yksinkertainen: vaaleanpunainen tarkoittaa laktoosia fermentoivaa organismia, väritön tai vaalea fermentoimatonta organismia. E. coli näyttää vaaleanpunaisesta punaiseen, ja sitä ympäröi usein sappisaostumakehä. Klebsiella ja Enterobacter näyttävät vaaleanpunaisilta ja ovat usein limaisia kapseliensa vuoksi. Salmonella, Shigella, Proteus ja monet muut gramnegatiiviset sauvat ovat värittömiä. Opetuslaboratorioissa on lisäksi yksi käytännöllinen etu: sappisuolat vähentävät yleensä Proteuksen parveilua, joten erillisiä pesäkkeitä on MacConkeylla helpompi saada kuin epäselektiivisillä kasvualustoilla. Esto ei kuitenkaan ole täydellistä, ja suolattomia vaihtoehtoja on saatavana silloin, kun parveilun hallinta on ensisijainen tavoite.

Väriaineiden tällaisen käyttäytymisen molekyylitason syy liittyy varaukseen ja rakenteeseen. Metyleenisininen on kationinen fenotiatsiiniväriaine, jonka rakenne ja ominaisuudet selittävät sen affiniteetin happamia bakteeripintoja kohtaan. Sama affiniteetti vaikuttaa myös sen saostumiseen EMB:n happamilla alueilla.

Vertailu yhdellä silmäyksellä

Lue taulukkoa päätöksentekomenetelmänä. Kun harjoituksessa halutaan opiskelijoiden näkevän fermentaation voimakkuuden jatkumo ja yksi näyttävä ääripää, EMB havainnollistaa sen. Kun harjoituksessa tarvitaan nopea kaksijakoinen erottelu ennen biokemiallista varmistusta, MacConkey tekee sen selkeästi.

Mikä kasvualusta millekin näytteelle

Vesiharjoituksissa, joiden tavoitteena on presumptiivinen ulosteperäisten koliformien tai E. colin tunnistaminen, EMB on houkutteleva vaihtoehto, koska hohde erottuu visuaalisesti. MacConkey soveltuu myös enteerisille gramnegatiivisille organismeille ja sitä on historiallisesti käytetty vesitutkimuksissa, mutta kumpikaan malja ei korvaa virallista vesitutkimusmenetelmää, jossa testistä riippuen voidaan määrätä käytettäväksi esimerkiksi modified mTEC- tai MI-kasvualustaa. Tarkista menetelmä, jota laboratoriosi on velvollinen noudattamaan.

Ulostenäytteitä jäljittelevissä harjoituksissa, joissa fermentoivia organismeja erotellaan fermentoimattomista, MacConkey on näistä kahdesta yleensä käyttökelpoisempi. Käytännön ulostenäytetyössä Salmonellan tai Shigellan tutkimiseen käytetään tavallisesti lisäksi selektiivisempiä enteerisiä kasvualustoja, kuten XLD:tä tai Hektoen enteric -agaria, eikä pelkkään MacConkeyhin tukeuduta.

Kliinistä työnkulkua jäljittelevässä virtsanäyteopetuksessa MacConkey kannattaa yhdistää veriagariin. MacConkey mahdollistaa gramnegatiivisten organismien varhaisen erottelun, kun taas veriagarilla kasvavat myös organismit, joiden kasvua MacConkey estää. Tätä yhdistelmää kuvataan kliinisissä virtsaviljelyn käytännöissä vakiintuneesti.

Puhtaassa käsiteopetuksessa käytä molempia. EMB opettaa, että fermentaation voimakkuudella on merkitystä ja että yksi molekyyli voi hoitaa kahta tehtävää. MacConkey opettaa modulaarista rakennetta: selektori, substraatti ja indikaattori pidetään erillään. Opiskelijat, jotka siirrostavat tunnetun E. colin, tunnetun Klebsiella aerogenes -kannan ja tunnetun Salmonella-kannan rinnakkain molemmille kasvualustoille, sekoittavat näiden kahden toimintalogiikat harvoin enää tämän jälkeen.

Tulkintavirheet, jotka toistuvat joka lukukaudella

Yleisin virhe on organismin tunnistaminen pelkän värin perusteella. MacConkeylla vaaleanpunainen pesäke voi olla E. coli, Klebsiella, Enterobacter tai jokin muu fermentoiva organismi. Väritön pesäke voi olla Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas tai jokin muu fermentoimaton organismi. Väri on seulontafenotyyppi, joka ohjaa varmistaviin tutkimuksiin, kuten Gram-värjäykseen, oksidaasitestiin, biokemiallisiin paneeleihin tai instrumentaaliseen tunnistukseen. Se ei ole lajin nimi.

Toinen virhe on puuttuvan hohteen ylitulkinta. Joissakin todellisissa E. coli -pesäkkeissä, erityisesti erillisissä pesäkkeissä, metallinhohtoa muodostuu vain vähän tai ei lainkaan EMB:llä. Hohteen puuttuminen ei sulje pois E. colia, eikä hohteen esiintyminen todista sen olevan E. coli. Käsittele hohdetta presumptiivisena vihjeenä.

Kolmas virhe on eri-ikäisten maljojen vertaaminen. Hitaasti laktoosia fermentoivat organismit voivat muuttua vaaleanpunaisiksi MacConkeylla pitkän inkuboinnin jälkeen, mikä hämärtää selkeää jakoa fermentoiviin ja fermentoimattomiin. Lue malja laboratorion määrittämänä ajankohtana ja kirjaa inkubointiaika tuloksen yhteyteen.

Neljäs virhe on sekakasvun tulkitseminen yhdeksi organismiksi. Vaaleanpunainen pesäke värittömän pesäkkeen vieressä edustaa kahta fenotyyppiä, ei niiden välimuotoa. Poimi hyvin eristyneet pesäkkeet ja käsittele kutakin morfotyyppiä erikseen. Limainen rakenne aiheuttaa vastaavan sudenkuopan: sekä Klebsiella että Enterobacter voivat näyttää limaisilta, joten kapseli ei yksin ratkaise tunnistusta. Aiemmin nimellä Enterobacter aerogenes opetettu organismi luokitellaan nykyisin nimellä Klebsiella aerogenes, mikä selittää vanhempien taulukoiden ja uudempien nimikkeiden näennäisen ristiriidan.

Kontrollit ja lopuksi yksi sääntö

Käytä jokaisella työskentelykerralla valokuvattuja tai tuoreita kontrolleja: E. coli voimakkaan fermentaatioreaktion kontrollina, Klebsiella aerogenes limaisen fermentaation kontrollina ilman klassista hohdetta, Salmonella-kanta värittömän fermentoimattoman reaktion kontrollina ja Staphylococcus aureus grampositiivisten organismien kasvun estymisen varmistamiseen juuri käyttämälläsi tuotteella. Sovita kantanumerot ja hyväksymiskriteerit valmistajan tuoteselosteeseen, koska selektiivisyys muuttuu sapen, kristallivioletin ja väriainepitoisuuden mukaan.

Muista työpisteellä yksi lause. EMB käyttää väriaineita, jotka sekä valikoivat että ilmaisevat, mikä antaa näyttävän E. coli -signaalin mutta vaatii hienovaraisempaa tulkintaa. MacConkey erottaa valikoinnin indikoinnista, mikä antaa yksinkertaisen vaaleanpunainen vastaan vaalea -jaon mutta vähemmän tietoa fermentaation voimakkuudesta. Valitse kasvualusta sen perusteella, mikä periaate vastaa kysymystä, varmista värin perusteella tehty arvio asianmukaisilla testeillä, jolloin maljat eivät enää kilpaile keskenään vaan täydentävät toisiaan.