Artikkel
Piima metüleensinise redutseerumistest: põhimõte ja piirangud
Üliõpilane tõstab üles kaks piimaga katseklaasi. Ühes muutus piim tunniga valgeks. Teises püsis see viis tundi sinisena. Ta osutab sinisele ja ütleb, et seda on ohutu juua.
See järeldus näitab testi vääriti mõistmist. Piima metüleensinise test ei tuvasta ohutust. See näitab, kui kiiresti langetab selles katseklaasis olev mikroobikooslus redokspotentsiaali kindlaksmääratud tingimustes. Aeglane tulemus tähendab proovi väikest summaarset metaboolset aktiivsust. See ei ütle midagi selle kohta, millised organismid proovis esinevad, kas nende seas on patogeene või kas piim pastöriseeriti õigesti.
See eristus on oluline, sest test näib veenev. Sinine värvus kaob. Kell annab arvu. Arvud ahvatlevad tegema põhjendamatuid järeldusi. See artikkel aitab tulemust kasulikult tõlgendada ja vältida ohtlikku tõlgendust.
Mida redutseerumine tegelikult mõõdab
Metüleensinine on oksüdeeritud kujul sinine ja leukometüleensiniseks redutseerituna peaaegu värvitu. Värske piim sisaldab lahustunud hapnikku, mis hoiab värvaine sinisena. Hingavad ja kääritavad bakterid tarbivad seda hapnikku ning vabastavad redutseerivaid ühendeid. Kui redokspotentsiaal langeb piisavalt madalale, võtab värvaine vastu elektrone ja kaotab värvuse. Guelphi ülikooli piimamikrobioloogia õppematerjal kirjeldab sama järjestust: hapniku eemaldamisele järgneb redutseerivate ainete teke bakterite ainevahetuse käigus.
Ajakirjas Journal of Dairy Science avaldatud klassikaline uurimus käsitleb seda kaheastmelise protsessina: mikrofloora kulutab esmalt hapniku ära, seejärel redutseerivad piima koostisosad värvaine kiiresti. Seega on piima metüleensinise redutseerumistesti kõige õigem mõista summaarse metaboolse aktiivsuse funktsionaalse analüüsina, mitte rakkude loendajana. Metüleensinise redokskäitumine selgitab selle muutuse keemilist alust.
Hapnik pöörab lõpp-punktis toimunud muutuse tagasi. Õhuga kokku puutuv redutseeritud leukovärvaine oksüdeerub uuesti ja muutub taas siniseks. Seetõttu lükkavad loksutamine, valamine, laiad katseklaasid ja suur õhuruum tulemuse saabumist edasi. Õhuga kokkupuutuval pinnal püsib sageli õhuke sinine rõngas pärast seda, kui ülejäänud katseklaasi sisu on värvituks muutunud. Standardprotseduurid lubavad selle rõnga alles jääda ega nõua selle kadumise ootamist.
Organismide tüüp lisab teise moonutava teguri. Kolibakterid ja paljud piimhappebakterid redutseerivad värvainet kiiresti. Paljud psührotroofsed ja termoresistentsed organismid redutseerivad seda aeglaselt või peaaegu üldse mitte. Kaks piimaproovi, mille mikroobide arv külvimeetodil on sama, võivad kaotada sinise värvuse mitmetunnise vahega. Juba see asjaolu välistab aja teisendamise kolooniate arvuks.
Kontrollitud laboriprotseduur
Välitingimustes kasutatavad ja õpikutes kirjeldatud variandid erinevad üksikasjades, mistõttu tulemus kehtib ainult selle andnud meetodi piires. Tavapärane toidulabori variant on järgmine:
- Koguge toorpiim minimaalse õhustamisega ja jahutage see kohe. Enne proovi võtmist segage õrnalt ümber pöörates.
- Viige 10 mL piima steriilsesse katseklaasi, milles on 1 mL värvaine töölahust. Üks laialt kasutatav töölahuse kontsentratsioon on 0.005 protsenti värvainet ning piima ja värvainelahuse suhe on 10 : 1.
- Sulgege katseklaas korgiga, pöörake seda õrnalt kaks korda ümber ja asetage mõne minuti jooksul veevanni. Tavapärane inkubatsioonitemperatuur on 35 kuni 38 kraadi Celsiuse järgi, olenevalt kasutatavast standardist. Märkige üles, millist standardit järgite.
- Kaitske katseklaase inkubatsiooni ajal valguse eest, sest valgus kiirendab redutseerumist.
- Vaadake tulemust 30 minuti möödudes ja seejärel kindlate ajavahemike järel. Lõpp-punkt on aeg, mil katseklaasi sisu vastab keedetud piima võrdlusproovile või saavutab protseduuris määratletud värvuse kao.
- Kui meetod seda nõuab, hoidke visuaalse kontrollina alles sama piima sisaldav töötlemata katseklaas.
FAO piima testimise käsiraamat annab selle järjestuse kohta selge välitingimustes kasutatava variandi: 10 mL piima ja 1 mL värvainelahust, korgiga sulgemine, õrn ümberpööramine, inkubeerimine ligikaudu 37 kuni 38 kraadi juures ning tulemuse vaatamine iga 30 minuti järel. Selle kontrollkatseklaasides kasutatakse keedetud piima, et hävitada loomulik redutseeriv süsteem ja anda värvuse võrdlemiseks kindel lähtealus.
Ülaltoodud skeem määratleb tingimused, mida tuleb kontrolli all hoida. Samad mahud, sama värvaine, sama temperatuur, sama segamine, sama valguskaitse, sama lõpp-punkti reegel. Muutke neist ükskõik millist ja muutub ka mõõdetav aeg. Seetõttu ei ole suvalise värvainekontsentratsiooniga kodused variandid võrreldavad labori kvaliteediklassidega.
Mida redutseerumisaeg näitab
Pikem aeg tähendab väiksemat summaarset aktiivsust kirjeldatud tingimustes. Lühem aeg tähendab suuremat summaarset aktiivsust. Piimanduse õppematerjalide tabelid seostavad nende aegadega ligikaudseid kvaliteediklasse: näiteks ühes BIS-ist lähtuva liigituse puhul tähendab 5 või enam tundi väga head ja alla 30 minuti halba kvaliteeti.
Oluline on mõista varieeruvust. 5 tunni tulemusel ei ole universaalset kvaliteediklassi. See kuulub protseduuri juurde, mis selle määratles. Seetõttu on põhjendatud tulemuse esitamise viis järgmine:
MBRT võrdub X tunniga nimetatud meetodi järgi ja vastab selle meetodi kvaliteediklassile.
See ei tähenda kunagi, et MBRT võrdub X kolooniaid moodustava ühikuga mL kohta. Standard Methods'i põhjal koostatud juhised ütlevad, et värvaine redutseerumise tulemusi ei tohiks esitada bakterite arvuna. Ka metüleensinisega lihtvärvimise protseduur vastab teistsugusele küsimusele, sest see näitab mikroskoobis rakkude kuju, mitte katseklaasi sisu summaarset aktiivsust.
Tõlgenduste ja piirangute tabel
See tabel on artikli algupärane võrdlusmaterjal. Lugege iga rida tervikuna. Ühtki lahtrit ei saa käsitleda eraldi.
| Tähelepanek või väide | Mida see näitab | Mida see ei saa tõendada | Peamised segavad tegurid |
|---|---|---|---|
| Sinise värvuse kiire kadu, alla 2 tunni ühe toorpiima liigituse järgi | Suur redutseeriv aktiivsus, mis on kooskõlas suure mikroobikoormuse või halva säilivusega | Liik, täpne arv, toksiinid või pastöriseerimise ebaõnnestumine | Soe säilituskeskkond, kolibakteririkas mikrofloora, valgus, väike värvainekogus |
| Vahepealne aeg, 2 kuni 4 tundi | Mõõdukas aktiivsus; kvaliteediklass kehtib ainult nimetatud liigituse piires | Ohutus või aeglaselt redutseerivate organismide puudumine | Kõrge inkubatsioonitemperatuur, õhustamise erinevused, rasva eraldumine |
| Aeglane redutseerumine, 5 või enam tundi | Väike summaarne aktiivsus selle liigituse piires | Patogeenide puudumine, pastöriseerimine või keemiline ohutus | Antibiootikumijäägid, säilitusained, täiendav lahustunud hapnik, suur värvainekogus |
| Pinnal püsib sinine rõngas, samal ajal kui ülejäänud sisu muutub värvituks | Taasoksüdeerumine õhu ja vedeliku piirpinnal, tavapärane piirpinnaefekt | Testi ebaõnnestumine või mittetäielik reaktsioon | Lai katseklaas, lõtv kork, korduv avamine kontrollimiseks |
| Valge katseklaas pärast kuumutatud piima inkubeerimist | Muutunud redutseeriv süsteem koos säilinud aktiivsusega | Et kuumutamine vastas valideeritud pastöriseerimisele | Kuumakahjustus, taastumine inkubatsiooni ajal, hilisem saastumine |
| Mis tahes üksik MBRT väärtus, mis on esitatud ilma meetodita | Testitingimused on teadmata | Mis tahes kvaliteediklass või mikroobide arv | Värvainelahuse koostis, suhe, temperatuur, segamine ja lõpp-punkti reegel on kõik esitamata |
Kasvul põhinevad kontrollid, näiteks bakterite kasvatamine söötmetel, jäävad loendamise ja isoleerimise vahendiks. Redutseerumistest katseklaasis annab sõeltulemuse. Külviplaat võimaldab tuvastada ja loendada.
Mida test ei saa ohutuse kohta tõendada
Aeglane tulemus ei saa tõendada patogeenide puudumist. Kliiniliselt olulisel hulgal esinev patogeen võib mõjutada summaarset hapnikutarbimist vähe. Patogeenide tuvastamiseks kasutatakse organismispetsiifilisi meetodeid, mida kehtiv Standard Methods käsitleb üldisest kvaliteedi sõeluuringust eraldi valdkonnana.
See ei saa kinnitada pastöriseerimist. Codexi piimahügieeni juhiste kohaselt kasutatakse kuumtöötluse kontrollimiseks aluselise fosfataasi testi või muud valideeritud meetodit. Valge või sinine katseklaas ei ütle midagi partii varasema aja-temperatuurirežiimi kohta.
See ei saa tõendada toiduohutust. Ohutus sõltub patogeenidest, juba moodustunud toksiinidest, ravimijääkidest, keemilistest saasteainetest, külmaahela ajaloost ja proovivõtujärgsest saastumisest. Codex käsitleb piimaohutust kontrollimeetmete ahelana, mitte ühe sõeltesti tulemusena.
Toidulabori tingimused ei ole kodune testimine
Piimanduslaboris kasutatakse testi vastuvõetava piima sõeluuringuks, tarnijate võrdlemiseks aja jooksul või redoksmikrobioloogia õpetamiseks juhendaja järelevalve all. Proovid on jälgitavad. Reaktiivid on standarditud. Temperatuurid registreeritakse. Jäätmed käideldakse laborijäätmetena.
Kodus testides ei ole sellest midagi tagatud. Köögis mõõdetud mahud on ligikaudsed. Internetis müüdavate värvainete kontsentratsioonid erinevad suuresti. Inkubeerimine toimub sageli soojas ruumis, mitte kalibreeritud veevannis. Värvimuutus toimub siiski, mistõttu tulemus tundub usaldusväärne, kuigi puuduvad kõik kontrollitud tingimused, mis sellele tähenduse annaksid.
Suurem risk puudutab käitumist. Kodune sinine katseklaas ahvatleb jooma toorpiima, mille labor suunaks ikkagi külvimeetodil loendamisele, patogeenide sõeluuringule ja jääkide kontrollile. Piima metüleensinise test töötati välja toorpiima kvaliteedi hindamiseks vastuvõtul, mitte piima tarbimiskõlblikkuse kinnitamiseks. Kiiremal resasuriini sõeltestil on sama piirang: värvust saab hinnata kiiremini, kuid vastust patogeenide kohta see endiselt ei anna.
Lühireegel laborilaua jaoks
Standardige värvaine, suhe, temperatuur, segamine, valgus ja lõpp-punkt. Esitage aeg koos meetodi nime ja kvaliteediklassiga. Tõlgendage minuteid koos säilitamisajaloo, mikrofloora tüübi, jääkide ja proovivõtu kvaliteediga. Lühike aeg osutab aktiivsusele, mida tasub uurida. Pikk aeg ei tõenda kunagi ohutust.