Metüleensinise kalibreerimiskõvera koostamine: tühiproovid, vahemik ja lineaarsus

Kaks analüütikut kasutavad sama metüleensinise põhilahuse pudelit ja koostavad kumbki kalibreerimiskõvera. Esimene saab koordinaatide alguspunkti läbiva sirge ja mõõdab tundmatuid proove kindlalt. Teine saab kõvera, mis ülemises otsas paindub, vabaliikme, mis ei ole nullilähedane, ning proovitulemused, mis lahjendamisel muutuvad. Sama värvaine, sama instrument, sama lainepikkus. Erinevus ei tulene oskustest. See tuleneb katse kavandamisest: mida tühiproov sisaldas, millised kontsentratsioonid valiti ja kas kontrollitud vahemik jäi piirkonda, kus üks lihtne mudel veel kehtib.

Kalibreerimiskõver on kokkulepe instrumendi signaali ja kontsentratsiooni vahel, mis kehtib ainult tingimustes, milles see koostati. Metüleensinise puhul on sellel kokkuleppel teadaolev nõrk koht. Värvaine molekulid assotsieeruvad vees omavahel, mistõttu neelduvate osakeste vorm muutub koos kontsentratsiooniga. Seda muutust hõlmav kalibreerimiskõver ei ole sirge ning ükski statistiline võte ei saa seda parandada. See artikkel näitab, kuidas kavandada kõver nii, et sirgel oleks sisuline tähendus: valida õige tühiproov, hoida vahemik monomeeride ülekaaluga piirkonnas, teha sisulisi kordusi ning käsitleda kõverust teabena, mitte mürana.

Alusta tühiproovist, mitte standardlahustest

Tühiproov määrab nulltaseme ja metüleensinise puhul peab see sisaldama kõike peale värvaine. Sama kvaliteediga vesi, sama puhver ja pH, samad soolad, sama kaaslahusti osakaal, sama temperatuur. Valmista kalibreerimislahused täpselt samas maatriksis. Põhjus on keemiline, mitte bürokraatlik. Sool ja lahusti nihutavad monomeeri, dimeeri ning suuremate agregaatide vahelist tasakaalu, mis muudab spektrit mõõtmislainepikkusel. Ainult vett sisaldav tühiproov ei saa korrigeerida maatriksist tingitud muutust osakeste vormide jaotuses. Metüleensinise vees mõõdetud spektrite globaalanalüüsis, mis on kättesaadav avatud juurdepääsuga kirje kaudu, varieeriti naatriumkloriidi sisaldust vahemikus 0 kuni 0.15 M just seetõttu, et ioontugevus nihutab tasakaalu; soolasisalduse suurenedes suurenes agregatsioon.

Üks praktiline järeldus: ära kunagi kalibreeri deioniseeritud vees ja mõõda seejärel proove fosfaatpuhvris või reovee filtraadis. Kui analüüdivaba maatriksit ei ole, on standardlisamise meetod otse proovis parem kui sobimatu maatriksiga väliskalibreerimiskõver. Täiendavad juhised vesilahustes tehtavate määramiste usaldusväärsuse tagamiseks leiad maatriksi ja segavate mõjude käsitlusest ning värvainete kvantitatiivse määramise üldpõhimõtted analüüsimeetodi kavandamise ülevaatest.

Vali vahemik, kus domineerib üks osakeste vorm

Kvantitatiivne määramine pikalainelisel neeldumisribal umbes 664 nm juures eeldab, et suurem osa värvainest on monomeerina. Puhtas vees kehtib see eeldus ainult lahjades lahustes, ligikaudu madalas mikromolaarses kontsentratsioonivahemikus. Avaldatud empiirilised tõusud näitavad selle piiri asukohta: 1 cm küvettides tehtud kalibreerimised, mille kontsentratsioon jäi alla umbes 7 mikromolaarse taseme, annavad tõusu ligikaudu 82,000 M-1 cm-1, samas kui umbes 37 mikromolaarse tasemeni laiendatud kalibreerimise puhul langeb see ligikaudu väärtuseni 67,100, sest kõige kontsentreeritumad standardlahused sisaldavad juba märkimisväärselt dimeere. Kõik siin nimetatud koefitsiendid on koos vastavate tingimustega esitatud metüleensinise spektraalsete võrdlusandmete artiklis, mis on õige koht arvude võrdlemiseks; selles artiklis kasutatakse neid ainult vahemiku määramiseks.

Sellest tulenevad otseselt järgmised kavandamisreeglid:

1. Hoia kõige kontsentreeritum standardlahus piisavalt lahjana, et spektri kuju püsiks muutumatuna. Meetodi väljatöötamisel skaneeri igal kontsentratsioonitasemel kogu nähtava valguse piirkond (umbes 550 kuni 750 nm), mitte ära mõõda ainult ühel lainepikkusel. Kui normaliseeritud spektrite kuju muutub koos kontsentratsiooniga, muutub ka keemiline koostis ja vahemik on liiga lai.
2. Jälgi neelduvuse suhet umbes 610 nm ja umbes 665 nm juures eri kontsentratsioonitasemetel. Kontsentratsiooniga kasvav suhe tähendab, et dimeeri spektraalne õlg suureneb ja monomeerimudel ei kehti enam. Seda diagnostilist võtet selgitatakse lähemalt agregatsiooni ja kontsentratsioonimõjude juhendis.
3. Kasuta madalas mikromolaarses vahemikus töötamiseks 1 cm küvetti. Kui tõus on ligikaudu 82,000, annab 5 mikromolaarne lahus neelduvuseks umbes 0.41 ja 10 mikromolaarne lahus umbes 0.82; mõlemad jäävad enamiku instrumentide jaoks sobivasse vahemikku.
4. Kontsentreeritud põhilahuste korral lühenda optilist teed, selle asemel et leppida neelduvusega, mis ületab tunduvalt 1, kuid pea meeles, et lühike optiline tee lahendab fotomeetrilise, mitte keemilise probleemi. Agregatsioon sõltub kontsentratsioonist, mitte optilise tee pikkusest, seega vajab kontsentreeritud põhilahus endiselt osakeste vormide jaotust arvestavat käsitlust, mitte lahjade monomeerlahuste kalibreerimiskõverat.

Suure osa selle käsitluse aluseks olev globaalne sobitus hõlmas 224 spektrit vahemikus 1.1 mikromolaarsest kuni 3.4 millimolaarse kontsentratsioonini ning näitas, et tetrameeri signaal oli tuvastatav juba alla 34 mikromolaarse taseme. See leid annab selge suuna: lineaarne vahemik on kitsam, kui vaistlikult arvata võiks, seega kontrolli seda, mitte ära eelda selle kehtivust.

Kontsentratsioonitasemed, kordused ja mõõtmisjärjekord

Kolme punktiga kõver ei tõesta midagi. ICH Q2(R2) valideerimisjuhend nõuab lineaarsuse hindamiseks vähemalt viit kontsentratsiooni ning kuus kuni kaheksa nullist erinevat taset annavad veenvama kalibreerimiskõvera, eriti ülemises otsas, kus algab agregatsioon. Jaota tasemed nii, et need kataksid kavandatud proovivahemiku, ning lisa punkte piirkonda, kus kõverus on kõige tõenäolisem, mitte ära vali mugavuse pärast geomeetrilist jada.

Mõõda iga taset kahes või kolmes korduses, valmistades lahused sõltumatult, mitte mõõtes ühest kolvist kolm korda. Sõltumatud kordused toovad esile valmistamisvea; sama kolvi korduvmõõtmised näitavad ainult instrumendi müra. 2020. aasta globaaluuringus mõõdeti iga lahust kolm korda, mis on endiselt mõistlik lähtekoht. Muuda mõõtmisjärjekord juhuslikuks, et triiv, klaasile adsorbeerumine või temperatuurimuutus ei saaks näida kõverusena. Kvartsküvettide uuringus leiti, et 34 mikromolaarsest lahusest adsorbeerus 10 minuti jooksul umbes 3 protsenti värvainest, seega hoia kontaktaeg, küvett, puhastus ja tööjärjestus kogu mõõteseeria vältel ühtlasena.

Selgitav arvutusnäide (mitte mõõteandmed)

Allpool toodud arvud on välja mõeldud arvutuskäigu näitamiseks. Need ei ole laborimõõtmised ja neid ei tohi viidata kui metüleensinise mõõteandmeid. Oluline on nendega seotud kontrollide loogika.

Oletame, et kuus standardlahust on sobitatud puhvris, optilise tee pikkus on 1 cm ja mõõtmine toimub 665 nm juures sobitatud tühiproovi suhtes:

Keskmise neelduvuse ja kontsentratsiooni vahelise seose sirgjooneline sobitus annab tõusuks ligikaudu 0.0805 neelduvusühikut mikromolaarse kontsentratsiooniühiku kohta ning vabaliige jääb nullist mõne millineelduvusühiku kaugusele. Tõusu jagamine optilise tee pikkusega teisendab selle näivaks neeldumisteguriks: 0.0805 mikromolaarse kontsentratsiooniühiku kohta vastab ligikaudu väärtusele 80,500 M-1 cm-1, mis on kooskõlas monomeeride ülekaaluga vahemikuga vees. Olulised kontrollnäitajad ei ole R-ruut, mis näeb mõlemal juhul suurepärane välja. Olulised on nullilähedane vabaliige, muutumatu A610/A665 suhe tasemetel S2 kuni S5 ning ilma suundumuseta hajutatud jäägid. Suhte suurenemine tasemel S6 on selge märguanne kas see tase välja jätta või märkida 7 mikromolaarne kontsentratsioon selle maatriksi ja instrumendi kombinatsiooni esialgseks ülempiiriks.

Tundmatu proov, mille neelduvus samades tingimustes on 0.245, teisendatakse otse: 0.245 jagatuna väärtusega 0.0805 mikromolaarse kontsentratsiooniühiku kohta annab ligikaudu 3.0 mikromolaarse kontsentratsiooni, enne proovi lahjendusteguri rakendamist. Esita tulemus koos tingimustega: lainepikkus, optilise tee pikkus, tühiproovi maatriks, kalibreerimisvahemik ja kuupäev.

Täidetav kalibreerimise tööleht

Kopeeri see mall iga uue maatriksi jaoks laboripäevikusse. Üks maatriks, üks leht, üks kõver.

Reaktiivi vormi rida on põhjusega olemas. Kaubanduslik metüleensinine võib olla veevaba sool või hüdraat, näiteks trihüdraat, ning vale molaarmass põhjustab märkamatult süstemaatilise vea igas nominaalses kontsentratsioonis. Lähtematerjali puhtuse ja spetsifikatsioonide kontrolli käsitletakse kvaliteedi ja kvaliteediklasside juhendis.

Kontrolli sõltumatu kontrollstandardiga

Kalibreerimiskõver ei tohiks kunagi iseenda õigsust hinnata. Pärast sobitamist valmista eraldi kaalutud ainest tehtud põhilahusest üks kontrollstandard, mille kontsentratsioon on vastuvõetud vahemiku keskosa lähedal, ning mõõda seda tundmatu proovina. Mõne protsendi piiresse jääv kokkulangevus kinnitab valmistamisahela õigsust; kõrvalekalle viitab pigem põhilahusele või lahjendustele kui instrumendile. Mõõda kontrollstandardit iga proovipartiiga. Kui selle tulemus triivib, kuid kõver ei muutu, kahtlusta enne proove töölahuseid või küvetti. See üks harjumus paljastab enamiku märkamatutest vigadest: hüdraadi molaarmassi kasutamine veevaba aine puhul, kalibreeringust väljas mikropipett või vale ioontugevusega valmistatud puhver. Märgi kontrollstandardi saagis töölehele tõusu kõrvale, et hilisem lugeja näeks, et sirget on kontrollitud, mitte lihtsalt joonistatud.

Mittelineaarsuse tõlgendamine vea põhjuse leidmiseks

Kui kõver paindub, aitab kõrvalekalde kuju põhjuse tuvastada. Allapoole paindumine suure neelduvuse juures koos muutumatu spektrikujuga viitab instrumendile, sageli hajusvalgusele, mis muudab suure neelduvuse mõõtetulemused tegelikust väiksemaks. Kõverus koos kasvava õlaga 610 nm juures viitab keemilistele muutustele: dimeerid ja suuremad agregaadid neelavad teisiti kui monomeer. Tühiproov, mida ei saa nullida, või standardlahused, mille neelduvus aja jooksul langeb, viitavad anumale: adsorptsioonile klaasile või küvettidele, eriti kui kontaktajad mõõteseeria jooksul varieerusid. Korralik punkte läbiv sirge, mis annab siiski valesid proovitulemusi, viitab maatriksile: proovid erinevad kalibreerimislahustest, seega koosta kõver uuesti proovi maatriksis või kasuta standardlisamise meetodit. Koosta igal juhul jääkide graafik kontsentratsiooni suhtes. Juhuslik hajuvus toetab sirgjoonelist mudelit; naeratust või kulmukortsutust meenutav muster lükkab selle ümber usaldusväärsemalt kui mis tahes R-ruudu lävend. Seda rõhutavad sõnaselgelt ka valideerimisjuhised.

Metüleensinise puhul tasub selline hoolikus ära. Selle monomeeri neeldumisriba on tugev, keemilised omadused on hästi kaardistatud ja kõrvalekalded annavad endast spektris märku enne, kui need arvulisi tulemusi moonutavad. Koosta kõver kitsas vahemikus, kasuta sobivat tühiproovi, valmista kordused sõltumatult ning lase spektrite kujul otsustada, milline vahemik sobib. Saadud sirge on lühike, kuid iga punkt sellel on usaldusväärne.

Selle artikli selgitavates arvutustes kasutatakse meetodi näitamiseks väljamõeldud arve. Mõõdetud võrdluskoefitsiendid koos täielike tingimustega on esitatud lingitud spektraalsete võrdlusandmete artiklis ning aluseks olev agregatsiooniuuring on indekseeritud tunnusega PMID 33251415.