Metüleensinine sebrakala uuringutes: kasvatuslisand ja eksperimente segav tegur

Sebrakala marjavesi on sageli õrnalt sinakas ning peaaegu keegi ei pane kirja, miks. Värvaine on metüleensinine, mida lisatakse seente vastu, ja enamik protokolle käsitleb seda taustana. Taust on siin vale mõiste. Sobivam on dokumenteerimata katsetegur: miski, mis esineb töödeldud katseanumates, kuid puudub kontrollides, on kasutatavatel kontsentratsioonidel farmakoloogiliselt aktiivne ning suudab muuta just neid tulemusnäitajaid, mida katse mõõdab.

See eristus on kogu järgneva käsitluse alus. Tavapärane seenevastane kasvatusvõte on üks küsimus. Kas lisand on teie analüüsi suhtes neutraalne, on teine. Hiljutine sebrakala käsitlev teaduskirjandus vastab esimesele rahustavalt ja teisele ebamugavalt.

Mida juhised tegelikult ette näevad

Ühtset standardit ei ole ning see on osa probleemist. Canadian Council on Animal Care'i juhised lubavad seente kasvu vähendamiseks marja ja vastsete transpordilahuses kasutada kontsentratsiooni 0.5 mg/L ehk 0.00005%. Euroopa katseloomajuhised kirjeldavad embrüote hoidmist söötmes, mis sisaldab sageli sama kontsentratsiooni, 0.00005%. Cold Spring Harbori E3 retsept näeb koostisosana ette kaks korda suurema koguse: 1 mg/L ehk 0.0001%. Selle kõrval torkab silma üks puuduv soovitus: OECD kalaembrüote toksilisuse katse juhend näeb ette taastatud koostisega lahjendusvee ja katsekemikaali, kuid ei soovita metüleensinist ei 2013. aasta versioonis ega hilisemas redaktsioonis. Nii kasvatab üks labor sebrakala embrüoid metüleensinisest sinises vees esimestest elutundidest alates, teine teeb nõuetele vastavat embrüokatset värvitu veega ning mõlemad nimetavad oma söödet tavaliseks. Kõik, kes võrdlevad eri laborite tulemusi või koondavad varasemate kontrollkatsete andmeid, peavad arvestama selle vastuoluga.

Kontsentratsioonide mõistmiseks: 0.00005% on ligikaudu 1.56 mikromolaarne ja 0.0001% ligikaudu 3.13 mikromolaarne. Need on väikesed arvud ning ahvatlev on pidada neid mõju avaldamiseks liiga väikseks. Allpool käsitletud uuringud kontrollivad just seda eeldust ja täpselt nendel kontsentratsioonidel.

Lugejad, kes tulevad kalapidamise, mitte laboritöö taustaga, kohtavad sama molekuli teises kontekstis, mida käsitleb metüleensinise akvaariumikasutuse juhend. Keemia on sama; selgitus selle kohta, kuidas värvaine rakus elektrone edasi kannab, aitab mõista, miks redoksaktiivne ühend ainevahetust käsitlevates teadusartiklites ikka ja jälle esile kerkib. Järgnev käsitlus puudutab konkreetselt metüleensinisega sebrakala marjavett.

Ainevahetus: mõju suund muutub arenguetapiga

Kõige informatiivsemas uuringus puutusid tavapäraselt arenevad sebrakalad värvainega kokku esimesest elupäevast kuni 5. viljastamisjärgse päevani ning igas arenguetapis mõõdeti oksüdatiivset ainevahetust, nagu kirjeldab embrüote ainevahetuskatsete avaldatud aruanne. Mustrit tasub täpselt sõnastada, sest selle suund pöördub.

1 päev pärast viljastamist suurenes kokkupuutes olnud embrüote hapnikutarbimine baastasemel mõlema kasvatuses kasutatava kontsentratsiooni korral. 2 päeva pärast viljastamist oli vastsete pinnakihis mitokondriaalne membraanipotentsiaal suurenenud kõigi kolme kontsentratsiooni puhul: 0.00005%, 0.0001% ja 0.0003%. 4. kuni 5. päevaks, pärast koorumist, oli mõju suund pöördunud: oksüdatiivne energiakulu vähenes, olenemata sellest, kas kokkupuude oli kestnud viljastamisest saadik või olnud äge ja piirdunud ajavahemikuga 3. päevast 4. päevani. Samal ajal vähenesid mitokondriaalsete hingamiskomplekside alaühikute transkriptide tasemed nii 1. kui ka 4. päeval koos steroidogeneesi ja glükoneogeneesiga seotud transkriptidega.

Veel kaks tähelepanekut täpsustavad pilti. Suurema kasvatuskontsentratsiooni korral toimus koorumine veidi varem: kokkupuutes olnud embrüod olid 2. päeval kontrollrühmast ees, kuid 3. päevaks oli kontrollrühm neile järele jõudnud. Stressitelg ise näis aga toimivat: kui 5-päevased vastsed puutusid kokku keerisliikumisest tingitud stressoriga, tõusis kogu organismi kortisoolitase mõlemas rühmas tavapäraselt. Seega ei ole värvaine nende koguste juures üldine arengumürk ega pärsi kõiki füsioloogilisi reaktsioone. See muudab energiaainevahetust arenguetapist sõltuvalt: enne koorumist suurendades ja pärast koorumist vähendades.

Käitumine: miks kaks uuringut erinevad ja miks mõlemal võib õigus olla

Käitumist käsitlev kirjandus näib vastuoluline seni, kuni kokkupuute korraldus kõrvuti asetada. Ühes arengulise ja käitumusliku ohutuse uuringus alustati embrüote kokkupuudet umbes 6 tundi pärast viljastamist, kasutati kuni 10 mikromolaarseid kontsentratsioone ja uuendati lahuseid iga päev kuni 4. päevani. Seejärel viidi vastsed 5. ja 6. päevaks värvainevabasse söötmesse ning 6. päeval uuriti nende liikumisaktiivsust valguse-pimeduse katses. Tulemus: olulist mõju suremusele, koorumisele ega morfoloogiale ei ilmnenud ning töötlus ei mõjutanud liikumisaktiivsust. Autorid soovitasid põhjendatult oma katsetingimustes ülempiiriks 10 mikromolaarset kontsentratsiooni.

Teine uurimisrühm, mille autorid osaliselt kattusid ainevahetusuuringu omadega, korraldas kokkupuute nii, nagu kasvatamisel tegelikult toimitakse: värvaine oli olemas alates 2 kuni 3 tunnist pärast viljastamist, lahust uuendati iga päev osaliselt ning käitumist mõõdeti kestva või hiljutise kokkupuute ajal. Samade tavapäraste kontsentratsioonide korral vähenes vastsete liikumisaktiivsus 24-tunnises katses; tulemus kordus eri liinides ja laborites. Käitumuslikke katseid segava mõju uuring seostas mõju serotonergilise toonusega, mis on kooskõlas värvaine teadaoleva monoamiini oksüdaasi pärssiva toimega. Kõige kõnekamalt varjas metüleensinist sisaldav embrüosööde oodatud liikumisreaktsiooni SSRI-le fluoksetiinile. Sinises vees tehtav sõelkatse võib seega jätta märkamata ravimi mõju, mille värvitu vesi esile tooks.

Tegelikku vastuolu ei ole. Ühendil ei pruugi ühes katses kaks päeva pärast väljapesu enam tuvastatavat järelmõju olla, kuid teises katses võib see kohal olles endiselt aktiivne olla. Praktiline järeldus on, et mõju puudumine toetab kontsentratsiooni ülempiiri määramist, mitte neutraalsuse väidet. Täheldatud mõju aga kirjeldab just olulist riski: aktiivset kokkupuudet mõõtmisperioodil täpselt sellises korralduses, mida enamik laboreid kasutab.

Redoksvärvaine redoksanalüüsis

Veel üks lõks väärib eraldi lõiku, sest see moonutab mitte looma, vaid mõõtevahendi tulemust. Alamar Blue energiakulu analüüs põhineb ise redokskeemial: resasuriin redutseerub fluorestseeruvaks resorufiiniks. Ka metüleensinine osaleb redokskeemias. Rakuvabades kontrollides vähendasid mõlemad kasvatuskontsentratsioonid Alamar Blue fluorestsentsi 24 tunni järel veidi, kuid statistiliselt oluliselt. Loomkatsetes pesti kokkupuutes olnud embrüoid enne analüüsi vähemalt kolm korda värvainevabas söötmes ning koorunud vastsete bioloogiline mõju ületas rakuvaba süsteemi häiringu. Seega on mõlemad väited tõesed: pestud loomadel säilib tegelik ainevahetuslik mõju ning välja pesemata värvaine lisab sellele otsese keemilise artefakti. Kontrollkatsed peavad need kaks eristama, vastasel juhul ei ole kummalgi arvul tähendust. Üldised juhised värvainepõhiste analüüsitulemuste tõlgendamiseks kehtivad siin eriti tugevalt.

Arenguetappide ajajoon

Selle artikli jaoks koostatud originaalmaterjal. Kui pole märgitud teisiti, on kontsentratsioonid kaks tavapärast kasvatusväärtust: 0.00005% ja 0.0001%.

Meelde tasub jätta ainevahetuse tulemusnäitajate varajane tõus ja hilisem langus. Käitumuslik mõju esineb kokkupuute ajal, kuid pärast aine eemaldumist organismist ei olnud seda tuvastada selles ühes katses, kus seda uuriti.

Kontrollkatsete kavandamise kontrollnimekiri

Teine selle artikli jaoks koostatud originaalmaterjal. Kasutage seda, kui metüleensinist sisaldavad sebrakala kasvatamise protokollid puutuvad kokku katsega.

1. Kirjeldage värvainet reagendi, mitte veena. Esitage kontsentratsioon nii protsentides kui ka mikromolaarsena, kokkupuute algus ja lõpp tundides või päevades pärast viljastamist, lahuse uuendamise ajakava ning väljapesu ajavahemik enne iga mõõtmist.
2. Sobitage kontrollid uurimisküsimusega. Katsekemikaali uuring vajab värvainevabu kontrolle; kasvatusvõtte uuring vajab värvainevaba ja värvainet sisaldava katseharu võrdlust koos seenevastase tulemuse registreerimisega, sest kumbki viidatud uuring ei mõõtnud seenevastast tõhusust.
3. Peske enne redoksanalüüse ja seejärel kontrollige. Loputage vähemalt kolm korda värvainevabas söötmes ning tehke paralleelselt rakuvaba värvaine ja reagendi kontrollkatse, sest värvaine vähendab Alamar Blue signaali otseselt.
4. Käsitlege käitumuslikke ja monoamiinidega seotud tulemusnäitajaid suure riskiga näitajatena. Liikumisaktiivsust, ehmatusreaktsiooni, ärevuselaadset käitumist, antidepressante ja MAO inhibiitoreid käsitlevates uuringutes tuleks mõõtmise ajal värvainet vältida või tõendada selle neutraalsust konkreetse tulemusnäitaja suhtes; ühe kuni kahe päeva pikkune väljapesu kõrvaldas ühe liikumisaktiivsuse mõju, kuid teiste katseparadigmade puhul ei ole seda tõendatud.
5. Käsitlege ainevahetuslikke ja mitokondriaalseid tulemusnäitajaid igas arenguetapis suure riskiga näitajatena. Hapnikutarbimine, energiakulu, membraanipotentsiaal ja hingamisahela transkriptide tasemed muutuvad kasvatuskontsentratsioonidel enne ja pärast koorumist vastupidistes suundades.
6. Ärge kandke neutraalsuse eeldust ühest katsekorraldusest teise. Mõju puudumine pärast väljapesu ei laiene kestvale kokkupuutele; morfoloogilise mõju puudumine ei laiene ainevahetusele ega koostoimele ravimiga; ühe liini, temperatuuri või katsekestuse juures saadud tulemus ei laiene teistele.
7. Nimetage järgitud juhis ja selle alternatiiv. Tooge CCAC, Euroopa või Cold Spring Harbori kontsentratsioonid selgelt välja ning märkige, et OECD embrüokatse juhis värvainet ei sisalda, et lugeja saaks teie loomade katsetingimused konteksti asetada.

Miski sellest ei räägi värvaine kasutamise vastu marja elus hoidmiseks. See räägib selle vastu, et kasvatusvalik jõuab andmetesse ilma lähemalt uurimata. Sinine värvus katseanumas tuleb farmakoloogilise toimega molekulist ning kõige tõenäolisemalt moonutuvad just suure läbilaskevõimega ainevahetuslikud ja neurokäitumuslikud sõeluuringud, mille jaoks praegu eelistatakse noori sebrakalu. Dokumenteerige see, kontrollige selle mõju, peske see enne mõõtmist välja ja kontrollige analüüsi, milles see võib märkamatult osaleda.