Metüleensinine ja progeeria: õppetunnid rakkude vananemise mudelist

Ühe tähe muutus ühes geenis paneb lapsed hirmutava kiirusega vananema. Juuste väljalangemine, jäigad liigesed, ahenenud arterid ja eeldatav eluiga vaid teismeeani. See haigus on Hutchinsoni-Gilfordi progeeriasündroom ning aastaid keskendusid selle uuringud rakutuumale, kus mutantne valk kahjustusi tekitab. Marylandi Ülikooli 2016. aasta uuring esitas teistsuguse küsimuse: millised näevad neis rakkudes välja mitokondrid? Vastus sidus omavahel raku kaks osa ning sajandivanune sinine värvaine mõjutas mõlemat.

Uuringu autorid on Xiong ja kolleegid ning see avaldati ajakirjas Aging Cell 2016. aastal. Kogu töö tehti kultiveeritud rakkudega. See asjaolu määrab kogu järgneva käsitluse raamid. Tulemused on ehtsad ja konkreetsed. Sama konkreetsed on piirid, mis lahutavad neid mis tahes ravist.

Mudel: üks mutatsioon, üks kinnijääv valk

Progeeria saab alguse C asendumisest T-ga LMNA geeni positsioonis 1824. See muutus ei muuda aminohapet. See aktiveerib varjatud splaissimiskoha, mille tõttu eemaldatakse lamiin A valgust 50 aminohapet. Lühenenud valk, mida nimetatakse progeriiniks, kaotab lõikekoha, mis tavaliselt võimaldaks rakul eemaldada selle farnesüülankru. Nii jääb progeriin püsivalt farnesüülituks ja kinnitub tuuma sisemembraanile, samal ajal kui normaalne lamiin A sealt korrapäraselt kinnitub ja vabaneb.

Tagajärjed rakutuumas on hästi dokumenteeritud ja mikroskoobi all nähtavad. Sileda ovaalse kuju säilitamise asemel tekivad tuumadele väljasopistused ja kortsud. Heterokromatiin ehk tihedalt pakitud, mitteaktiivne DNA, mis tavaliselt paikneb tuuma servas, hõreneb. Tuhandete geenide avaldumine muutub. Kujutage tuumalamiini ette tapeeditaguse tugikarkassina: kui üks karkassi osa keevitatakse valesse kohta, hakkab sein kummuma ja tapeedimuster moondub kogu ruumis.

Uuringus kasutati progeeriapatsientide naha fibroblaste koos sama passaažiarvuga kontrollrakkudega ning lisaks teist rakuliini, mida oli muundatud nii, et normaalsed fibroblastid toodaksid otse progeriini. Muundatud rakkudes tekkisid samad defektid, mis näitab, et põhjus oli progeriinis, mitte patsientide haigusloos või kultiveerimise kestuses. Raskusaste sõltus kogusest: rohkem progeriini ekspresseerivas rakuliinis olid kõik defektid tõsisemad.

Millised nägid välja mitokondrid

Tervete fibroblastide mitokondrid moodustavad tuuma ümber hargneva võrgustiku: pikad torukesed, mis liiguvad mööda tsütoskeleti radu. Progeeria rakuliinides oli see võrgustik kadunud. Suurem osa mitokondritest oli fragmenteerunud, paljud olid tursunud ning elektronmikroskoopia näitas tugevalt kahjustatud organellide hulga ligikaudu kahekordset suurenemist. Aegvõtted näitasid, et need läbisid lühemaid vahemaid ja liikusid aeglasemalt kui kontrollrakkude mitokondrid.

Talitlus muutus koos kujuga. Mitokondriaalse superoksiidi ja kogu raku oksüdantide tase tõusis. Rohkemates rakkudes oli membraanipotentsiaal häirunud. ATP tootmine vähenes. Eraldi võttes ei ole ükski neist leidudest üllatav, sest kahjustatud mitokondritest lekib reaktiivseid hapnikuühendeid ja need toodavad vähem energiat. Uus oli pakutud põhjus. PGC-1alpha, transkriptsiooni koaktivaator, mis juhib mitokondrite biogeneesi selliste allavoolu tegurite kaudu nagu NRF1, TFAM ning ühinemise ja jagunemise regulaatorid MFN1, MFN2, OPA1, FIS1 ja DRP1, oli progeeriarakkudes mRNA tasemel ligikaudu kaheksakordselt alla surutud ning vastavalt vähenes ka valgu hulk. Näis, et progeriin surub maha mitokondrite loomise ja säilitamise pealülitit. See seos tuumalamiini kahjustuse ja energiaainevahetuse vahel kuulub mitokondriaalse energiatootmise laiemasse käsitlusse ning sama tasakaalu oksüdantidega seotud poolt käsitletakse oksüdatiivse stressi ja ROS-i kontrolli teemas.

Mida metüleensinine muutis

Uurijad töötlesid rakke nädalaid pidevalt metüleensinise madala, 100 nanomolaarse kontsentratsiooniga. Rakukultuuri mõistes on see pikk ja leebe kokkupuude, mitte lühike ravimiimpulss. Metüleensinine liigub oksüdeerunud ja redutseerunud vormi vahel ning suudab mitokondrites elektrone üle kanda. Seetõttu kirjeldatakse seda mitokondritele suunatud redoksühendina, mitte tavalise antioksüdandina, mis ühe oksüdandi neutraliseerimisel ära kulub.

Mitokondrid reageerisid nii normaalsetes kui ka progeeriarakkudes. ATP tase tõusis, oksüdantide tase langes ja tugevalt defektsete mitokondrite osakaal vähenes. PGC-1alpha ekspressioon taastus osaliselt koos mõne selle allavoolu sihtmärgiga. Seni on tegu üldise mitokondrite talitlust toetava mõjuga, mis ei ole progeeriale eriomane.

Rakutuumaga seotud tulemused olid üllatavad ning need ilmnesid just haigetes rakkudes. Kvantitatiivne kujuanalüüs näitas tuuma väljasopistuste vähenemist. Lamiinide A ja C koguhulk suurenes. Kõige silmatorkavam oli progeriini ümberjaotumine: töötlemata progeeriarakkudes paiknes ainult umbes 30 protsenti progeriinist nukleoplasma lahustuvas fraktsioonis, ülejäänu oli kinnitunud membraanile. Pärast töötlemist tõusis lahustuva osa osakaal ligikaudu 65 protsendini, lähenedes normaalse lamiini käitumisele. Membraanist vabanenuna tõmbab progeriin vähem naabervalke endaga kaasa ning ka lamiinide A ja C lahustuvad fraktsioonid taastusid.

Selle vabanemise tulemusena paranesid kaks rakutuuma fenotüübilist tunnust. Tuuma servas paiknev heterokromatiin, mida uuriti elektronmikroskoopia ja heterokromatiinivalgu HP1-alpha värvimise abil, oli nähtavalt taastunud. RNA sekveneerimine näitas ka transkriptoomi nihkumist tagasi normaalse suunas: töötlemata progeeriarakud erinesid kontrollrakkudest enam kui 3,200 geeni poolest, töödeldud progeeriarakud aga umbes 1,670 geeni poolest. Normaalsetes rakkudes muutis sama töötlemine vaid mõnekümne geeni avaldumist, mis viitab sellele, et tuumale avalduv mõju on seotud progeriiniga, mitte üldise transkriptsioonilise nihkega. Põhimõtet, et raku- ja loomamudelid vastavad kitsamatele küsimustele, kui pealkirjad mõista annavad, selgitatakse artiklis kuidas lugeda metüleensinise uuringuid.

Miks see ei ole ravi

Neli piirangut hoiavad selle uuringu seal, kuhu see kuulub: laboris.

Esiteks toimus kõik kultiveerimisnõudes. Kultiveeritud fibroblastidel puuduvad verevarustus, immuunsüsteemi kontekst, kudede ülesehitus ja kogu organismi farmakoloogia, mis määrab, kas ühend üldse sihtmärgini jõuab. Selles uuringus ei manustatud ainet ühelegi loomale ega ravitud ühtegi patsienti.

Teiseks on progeeria fibroblastid ühe rakutüübi mudel. Haigus põhjustab surma peamiselt arterite, luude ja rasvkoe kahjustuste kaudu ning uuringus vaadeldi ainult fibroblaste ja ühte silelihasrakkude preparaati. Teised koed võivad käituda teisiti.

Kolmandaks saavutati rakutuuma taastumine nädalaid kestnud pideva nanomolaarse kokkupuute tulemusena kultuurisöötmes. Kontsentratsioonid kultiveerimisnõus ei ole annused ning miski selles artiklis ei teisenda 100 nanomolaarset kontsentratsiooni söötmes inimese raviskeemiks. Metüleensinisel on muudes meditsiinilistes kasutusvaldkondades oma annuse-toime seos ja ohutusprofiil ning see uuring ei anna alust koduseks kasutamiseks. Üldist ohutusteavet käsitletakse artiklis metüleensinise ohutus ja kõrvaltoimed.

Neljandaks ei ole progeeria normaalne vananemine. See on haruldane, ühest mutatsioonist põhjustatud haigus, mille puhul rakutuuma tugikarkass kahjustub kindlal viisil. Ühend, mis leevendab seda konkreetset kahjustust kultiveeritud rakkudes, ütleb vähe vananemise kohta inimestel, kellel seda mutatsiooni ei ole. Rakuline fenotüüp avab vaate tuuma ja mitokondrite vastastikmõjule, mitte ei anna tulemust pikaealisuse kohta.

Seega peab tasakaalustatud kokkuvõte jääma tingimuslikuks. Progeeria fibroblastides surub progeriin alla PGC-1alpha ning jätab mitokondrid fragmenteerunuks, loiuks, oksüdantiderohkeks ja energiavaeseks. Madala kontsentratsiooniga metüleensinine taastas mitokondrite näitajaid kõigis rakkudes ning vabastas haigetes rakkudes lisaks progeriini tuumamembraanist, millega kaasnes tuuma kuju, heterokromatiini ja geeniekspressiooni osaline taastumine. See kahetine toime teeb uuringu tundmisväärseks. See ei muuda metüleensinist progeeria ega vananemise raviks.