Metüleensinisega pärmikatsed: elusrakkude loendamine ja hingamise ajastamine

Laborilaual seisab kaks katseklaasi. Mõlemad on sinised. Ühes tähendavad mikroskoobi all nähtavad sinised rakud surnud pärmi. Teises tähendab katseklaasi muutumine sinisest värvituks, et pärm on elus ja hingab. Sama värvaine, vastupidised tõlgendused. Kui need kaks katset segi ajada, pöörduvad kõik järeldused pea peale.

See erinevus ongi artikli keskne teema. Metüleensinine on redoksvärvaine: oksüdeeritult on see sinine, redutseeritult aga värvitu leukometüleensinine. Eluvõimelisuse loendamisel kasutatakse seda keemiat lühikese mikroskoobivaatluse käigus. Hingamiskatses kasutatakse seda kogu proovis toimuva reaktsiooni aja mõõtmiseks. Mõlemad vajavad oma protokolli, oma kontrolle ja oma kriitilist hindamist.

Eluvõimelisuse loendamine: lühike värvimine, kiire hindamine

Õllepruulimises kasutatav protokoll on kõige standardiseeritum variant. Valmistage 0.01% w/v metüleensinise lahus 2% naatriumtsitraadis, segage see pärmisuspensiooniga suhtes 1:1 ja uurige segu lühikese, kindlaksmääratud aja järel. Avaldatud ooteajad ulatuvad 1 kuni 2 minutist Brewing Science Institute'i käsiraamatus ligikaudu 5 minutini uurimisprotokollides; OIV veini mikrobioloogilise analüüsi meetod nõuab vaatlust 10 minuti jooksul. Värvaine lõppkontsentratsioon loendussegus on ligikaudu 0.005%. Täitke täiustatud Neubaueri loenduskamber ning liigitage ligikaudu 400x suurendusel tumesinised rakud eluvõimetuteks ja värvumata rakud eluvõimelisteks. OIV meetodis loetakse helesinised rakud elusaks, mis viitab juba allpool käsitletavale subjektiivsuse probleemile.

Rakkude kontsentratsioon arvutatakse kambri geomeetria põhjal. Kui loendatakse kogu keskne 1 mm küljepikkusega ruut, võrdub rakkude arv mL kohta N korda lahjendustegur korda 10^4, kus N on sellel alal loendatud rakkude arv, nagu on kirjeldatud ASBC pärmianalüüsi meetodites. Eluvõimelisuse arvutus on lihtsam: värvumata rakkude arv jagatud rakkude koguarvuga, korrutatud 100-ga. Eluvõimelisuse hindamiseks loendage ligikaudu 400 rakku, järgides FEMS-i õllepruulimise võrdlusuuringut ja OIV praktikat. Kasutage järjekindlalt üht piirjoonte reeglit, näiteks loendage alumisel ja vasakul ruudustikujoonel olevad rakud, kuid jätke ülemisel ja paremal joonel olevad rakud välja.

Pungade loendamise reegel tuleb määrata enne loendamise algust. Levinud tava järgi loetakse pung eraldi rakuks siis, kui see saavutab ligikaudu poole emaraku suurusest; väiksem pung loetakse koos emarakuga üheks rakuks. Ükskõik millise reegli valite, rakendage seda igas ruudus ja märkige see töölehele, et järgmine inimene kasutaks sama reeglit.

Loendamise tööleht (printige välja)

See tööleht on loodud spetsiaalselt selle artikli jaoks. Kopeerige see märkmikku või printige iga proovi jaoks üks eksemplar.

Eluvõimelisus (%) = 100 x värvumata / (värvumata + tumesinised). Rakkude koguarv mL kohta = N x lahjendustegur x 10^4, kus N pärineb kindlaksmääratud kambrialalt. Märkige värvimisaeg tulemuse kõrvale, sest eluvõimelisuse näit ilma ajastuseta ei ole korratav.

Miks eluvõimelisuse näidud muutuvad

Esimene häiriv tegur on ajastus ja selle mõju võib olla kahesuunaline. Metaboolselt aktiivsed rakud redutseerivad värvainet, mistõttu võib liiga varane hindamine tabada elusrakke enne redutseerumise lõppu ja liigitada need ekslikult surnuks. Pikaajaline kokkupuude on aga ise toksiline ning tekitab päriselt kahjustunud siniseid rakke, andes eksitava värvumistulemuse. Seetõttu nõuab üks laboriõppe protokoll hindamist 5 minuti jooksul, nagu on kirjas Wisconsini pärmikatsete õppeprotokollis. Kindel järeldus on, et metüleensinisega hindamine sõltub ajast: määrake üks lühike ajavahemik ja hoidke see kõigi seeria proovide puhul muutumatuna.

Väikese eluvõimelisusega proovidega kaasneb teine süstemaatiline viga. Standardiseeritud meetod hoiatab, et metüleensinine võib tegelikku eluvõimelisust üle hinnata, kui see jääb alla ligikaudu 80%, sest värvainet endiselt redutseerivad rakud ei pruugi säilitada paljunemisvõimet. Õllepruulimise kirjanduses kirjeldatakse sama ebausaldusväärsust märgatavalt vähenenud eluvõimelisuse korral. Käsitlege metüleensinisega saadud tulemust kiire ligikaudse hinnanguna ning kinnitage väikese eluvõimelisuse korral olulised otsused, näiteks kultuuri taaskasutamine järgmise partii kääritamiseks, külviloenduse või täiendava värvimismeetodiga.

Kolmandaks mõjutab tulemust proovimaatriks. OIV meetodit kasutatakse pH ligikaudu 4.6 juures ning selles hoiatatakse, et tugevalt puhverdatud madala pH-ga proovid takistavad värvaine õiget toimimist. Samuti ei soovitata katset kasutada suhkrusisalduse korral üle 100 g/L, sest rakud paistavad siis eksitavalt helesinised. Värvimise pH katseline võrdlus näitas testitud vahemikus tundlikkuse olulist muutumist, mis on kooskõlas metüleensinise meetodi pH-sõltuvuse uuringuga. Kõrvalised osakesed on eraldi lõks: ebapuhastes meskides leiduvad värvunud osakesed meenutavad surnud rakke ja suurendavad hindajatevahelist varieeruvust.

Seda varieeruvust on mõõdetud, mitte üksnes tähele pandud. FEMS-i pärmimeetodite võrdluses kirjeldatud kuuekuulises õlletehase katses oli metüleensinise kordusmõõtmiste keskmine standardhälve 6.1%, oksanooliga läbivoolutsütomeetria puhul aga 0.2%; kahe hindaja tulemused erinesid sama proovi korral kuni 13 protsendipunkti. 2023. aasta eluvõimelisuse meetodite kvantitatiivses võrdluses leiti, et fluorestsentsmikroskoopia ja läbivoolutsütomeetria on märksa täpsemad, kuid nende toimivus sõltub liigist ja proovimaatriksist. Paintingi ja Kirsopi klassikaline meetodikirjeldus (PMID 24430080) jääb lähteallikaks ning laiem ülevaade pärmi eluvõimelisuse ja vitaalsuse testidest (PMID 25154541) käsitleb metüleensinist pigem täiendava kui lõpliku testina. Trüpaansinine ei ole siin automaatselt parem valik: see näitab membraani terviklikkuse kadu, metüleensinine aga värvaine omastamist koos redutseeriva aktiivsusega, mistõttu võivad stressis rakud kahe värvainega saada erineva liigituse.

Hingamiskatse: mõõtke sinise värvuse kadumise aega

Teises katses mikroskoopi ei kasutata. Pärm, glükoos ja lahja metüleensinise lahus pannakse suletud katseklaasi ning mõõdetakse, kui kaua kulub sinise värvuse kadumiseks. Rakkude ainevahetuses tekivad redutseerivad ekvivalendid, mis muudavad sinise värvaine värvituks vormiks, samal ajal kui lahustunud hapnik oksüdeerib selle tagasi. Kui rakud on hapnikusisaldust vähendanud, hakkab redutseerumine ülekaalu saavutama ja katseklaasi sisu muutub värvituks. Seega peegeldab lõpp-punkt hingamise, värvaine kontsentratsiooni ja hapniku kättesaadavuse tasakaalu. Tulemus tuleb esitada metüleensinise redutseerumise või värvuse kadumise ajana, mitte molekulaarse hapniku tarbimise otsese kiirusena.

Kasutage palju lahjemat värvainelahust kui eluvõimelisuse määramisel, et mõõtmisaeg jääks sobivasse vahemikku. AQA A-taseme kohustuslike praktiliste tööde käsiraamat standardiseerib seda hästi: 1 g glükoosi 100 mL vees, mis on soojendatud ligikaudu 30 C-ni, 5 g kuivpärmi lisatuna vahetult enne kasutamist ning ligikaudu 0.001% värvaine töölahus, mis valmistatakse 0.1 mL 1% põhilahuse lahjendamisel lõppmahuni 100 mL. Segage 2 mL pärmi-glükoosisuspensiooni 2 mL värvaine töölahusega, laske saavutada katsetemperatuur, loksutage üks kord 10 sekundit, käivitage taimer ja ärge enam loksutage. Loksutamine viib lahusesse uuesti hapnikku ja muudab katseklaasi sisu taas siniseks; see on protseduuri suurim artefakt. AQA märgib, et segu peaks 35 C juures tavaliselt muutuma värvituks ligikaudu 5 minuti jooksul; katsete keskmised ajad olid 275 s temperatuuril 20 C, 128 s temperatuuril 35 C ja 145 s temperatuuril 45 C. Need on ühe katsekorralduse näited, mitte universaalsed võrdlusväärtused. Kvantitatiivset seost redutseerumiskiiruse ja metaboolselt aktiivse pärmi vahel kontrollitud tingimustes toetavad spetsiaalsed redutseerumisuuringud, sealhulgas töö tunnusega PMID 25773544 ning mehhanismiuuring ajakirjas Yeast (2014).

Ajakulu näide (originaalmaterjal)

Allolev tabel on selle artikli jaoks koostatud näide, mis kasutab eespool kirjeldatud AQA-laadset katsekorraldust: 2 mL pärmi-glükoosisegu ja 2 mL ligikaudu 0.001% värvaine töölahust, üks 10-sekundiline loksutamine ning seejärel häirimatu inkubeerimine. Tabelis on näidisnäidud sellisel kujul, nagu õpilasrühm peaks need kirja panema; kiirusindeks on määratletud kui 1 jagatud värvuse kadumise ajaga sekundites. Tehke katsed samade katseklaasidega ja asendage need sissekanded mõõdetud väärtustega.

Koostage katseklaaside A, B ja C kiirusindeksi sõltuvuse graafik temperatuurist. Kõver tõuseb ning seejärel tasandub või langeb: see on ensüümide juhitud protsessile ootuspärane kuju, mitte sirgjoon. Katseklaasid D, E ja F ei ole selle kõvera andmepunktid. Need on kontrollid, mis võimaldavad kõverat tõlgendada.

Kontrollid, mis annavad kummagi katse tulemustele tähenduse

Iga hingamiskatse vajab kolme kaasproovi. Keedetud või surmatud pärm koos glükoosi ja värvainega peaks jääma siniseks, näidates, et kiire redutseerumine sõltub elusrakkude ainevahetusest. Eluspärm koos värvainega, kuid ilma lisatud glükoosita, on substraadikontroll; siiski võib oodata aeglast värvuse kadumist, sest pärm kasutab oma rakusiseseid varusid. Glükoos koos värvainega, kuid ilma pärmita, on keemiline tühiproov. See on hädavajalik, sest aluselises keskkonnas võib glükoos redutseerida metüleensinist ka ilma rakkudeta.

Eluvõimelisuse loendamine vajab teistsugust kontrolli: protseduuri muutumatust. Sama värvaine põhilahus, sama segamissuhe, sama värvimisaeg, sama kambriala, samad pungade ja piirjoonte reeglid ning võimaluse korral pimeloendamine. Kui kahe hindaja tulemused erinevad kümne protsendipunkti võrra, näitab tööleht tavaliselt põhjust: erinev ajastus, erinev sinise värvuse lävend või erinevad pungade loendamise reeglid. Värvitud rakkude ettevalmistamise ja vaatlemise võtted seostuvad bakterite lihtvärvimise meetoditega, laiem ülevaade sellest, mida värvaine eri proovides esile toob, on aga mikroskoopiliste värvimiste atlases. Sinise värvuse intensiivsuse kvantitatiivse hindamise füüsikalist tausta selgitab mõõtmistingimustega varustatud neeldumise teatmematerjal: iga koefitsiendiga peavad kaasas käima lahusti, pH ja kontsentratsiooni tingimused.

Valige katse küsimuse järgi. Kui palju rakke on praegu elus, on loendamise küsimus, millele vastatakse mikroskoobi ja töölehe abil. Kui aktiivselt see kultuur hingab, on kineetika küsimus, millele vastatakse stopperi ja kontrollitud katseklaasidega. Metüleensinine sobib mõlemaks, kuid mitte kunagi samas katseklaasis samal ajal.