Metüleensinine ja põletikulised signaalirajad: inflammasoomid, IL-6 ja STAT3

Oletame, et kolm laborit teatavad sama sinise ühendi põletikuvastasest toimest. Üks näitab, et makrofaagid vabastavad vähem IL-1beta. Teine näitab samas rakutüübis vähem iNOS-ensüümi. Kolmas näitab vähem IL-6 veres ja väiksemat STAT3 aktiivsust ajus. Tekib kiusatus ühendada need kolm tulemust üheks väiteks. Selline ühendamine varjab tegelikke leide.

Iga tulemus kuulub erineva signaalimehhanismi juurde, millel on oma käivitaja, kokkupanekuetapp ja mõõdetav näitaja. Metüleensinine mõjutab iga mehhanismi eri punktis. See, kas mõni neist mõjudest parandab tervisetulemust, on eraldi küsimus, mida käsitleme oma ülevaates metüleensinisest ja põletikust. Siin keskendume signaaliradadele.

Signaalirada 1: inflammasoomi kokkupanek ja kaspaas-1

Inflammasoom on valguline karkass, mis pannakse vajaduse korral kokku müeloidse raku sees. Selle osad on sensor, adaptorvalk nimega ASC ja efektorensüüm nimega kaspaas-1. Pärast kompleksi kokkupanekut lõikab kaspaas-1 pro-IL-1beta ja pro-IL-18 nende sekreteeritavateks vormideks ning võib käivitada püroptoosi, põletikulise rakusurma vormi. Sensor määrab tüübi: NLRP3 reageerib kristallidele ja poore moodustavatele toksiinidele, näiteks nigeritsiinile, ning ATP-le; NLRC4 reageerib bakteriaalsele flagelliinile; AIM2 reageerib tsütosoolsele kaheahelalisele DNA-le; mittekanooniline rada reageerib rakusisesele lipopolüsahhariidile.

Aktiveerimiseks on vaja kaht signaali. Esimene signaal on ettevalmistus: Tolli-laadse retseptori ligand käivitab NLRP3 ja pro-IL-1beta NF-kB-st sõltuva transkriptsiooni, et vajalikud osad oleksid olemas. Teine signaal on kokkupanek: teine käivitaja paneb ASC oligomeriseeruma punktjateks kogumikeks, kaspaas-1 lõikuma p20-fragmendiks ja küpse IL-1beta p17 vabanema. Mitokondriaalsed reaktiivsed hapnikuühendid ja kristallide omastamine aitavad teadaolevalt kaasa NLRP3 teisele signaalile.

2017. aasta makrofaagiuuringus inflammasoomide laiaulatusliku inhibeerimise kohta katsetati metüleensinist mõlema signaali juures. Lipopolüsahhariidiga ettevalmistatud hiire luuüdi makrofaagides kutsusid nigeritsiin, ATP ja mononaatriumuraadi kristallid kõik esile IL-1beta ja kaspaas-1 vabanemise ning ASC punktjate kogumike tekke. Metüleensinine kontsentratsioonidel 20 kuni 200 mikromolaari vähendas kõiki kolme kontsentratsioonist sõltuvalt, rakke surmamata. Sama muster ilmnes NLRC4 korral flagelliini ja Salmonella, AIM2 korral kaheahelalise DNA ja Listeria ning mittekanoonilise raja korral transfekteeritud lipopolüsahhariidi või elusate E. coli bakteritega. Ühend üksi ei käivitanud vabanemist ning kontrollplaatidel ei ilmnenud antibakteriaalset toimet, seega puudutab tulemus peremeesorganismi reaktsiooni.

Raja varasemates etappides mõõdeti kolme sekkumiskohta. Rotenooni tekitatud mitokondriaalse superoksiidi hulk vähenes metüleensinise toimel ning koos sellega vähenes ka rotenooni käivitatud IL-1beta vabanemine. Fluorestseeruvate osakeste omastamine vähenes, mis on kooskõlas fagotsütoosi vähenemisega enne kristallide tuvastamist. Kahe NF-kB seondumiskohaga NLRP3 promootori juhitud reporteri aktiivsus oli metüleensinise toimel väiksem, kuid ilma nende kohtadeta lühendatud promootor ei reageerinud. Rakuvabas katseklaasis vähendas metüleensinine otseselt ka rekombinantse inimese kaspaas-1 aktiivsust. Ühendi lisamine ainult ettevalmistuse või ainult aktiveerimise ajal vähendas endiselt IL-1beta, IL-18 ja kaspaas-1 vabanemist, seega on haaratud mõlemad etapid.

Hiirekatsed kinnitasid seda valikulisust. Surmav lipopolüsahhariidiannus tappis kontrollrühma hiired mõne tunni jooksul, metüleensinine aga parandas elulemust; kõhukelmevedelikus vähenes IL-1beta, kuid IL-6 samas vedelikus ei vähenenud. Listeria põhjustatud peritoniidi mudelis vähenes kõhukelmevedeliku IL-1beta, samal ajal kui rakkude koguarv jäi muutumatuks. Inimese THP-1 monotsüüdid käitusid kõigi nelja inflammasoomitüübi puhul nagu hiire makrofaagid. Inflammasoomi puudutav tulemus selgitab IL-1beta ja IL-18 küpsemist, mitte kõigi tsütokiinide käitumist. Seetõttu vastab ka aju immuunrakkude kuju mikrogliia ja astrotsüütide katsetes teisele küsimusele kui valgulise karkassi kokkupanek.

Signaalirada 2: iNOS-i transkriptsioon NF-kB ja STAT1 seondumise kaudu

Indutseeritavat lämmastikoksiidi süntaasi ehk iNOS-i leidub puhkeolekus väga vähe ning selle transkriptsioon käivitatakse vajaduse korral. Lipopolüsahhariid käivitab selle peamiselt IkB-alpha lagundamise kaudu, millele järgnevad NF-kB fosforüülimine ja sisenemine tuuma. Interferoon-gamma käivitab selle peamiselt STAT1 fosforüülimise kaudu Januse kinaasi poolt, millele järgneb STAT1 sisenemine tuuma. Seejärel seondub kumbki faktor oma kohaga iNOS-i promootoril. Ensüümi aktiivsus ja geeni induktsioon on eraldi kontrollpunktid ning ravim võib toimida ühes või mõlemas.

2015. aasta uuringus iNOS-i induktsiooni kohta makrofaagides ja endotokseemiaga hiirtel lokaliseeriti toime mRNA tasandile. RAW 264.7 rakkudes ja hiire primaarsetes makrofaagides vähendas 1 mikromolaarne metüleensinine, mida lisati 30 minutit enne lipopolüsahhariidi, interferoon-gammat või mõlemat, iNOS-valku ja mRNA-d 8 kuni 24 tunni jooksul. Söötmes oli vähem nitritit ning rakkude eluvõime ei vähenenud. Hiirtel, kellele manustati lipopolüsahhariidi 25 mg kg kohta, vähendas tund varem manustatud ühekordne annus 5 mg kg kohta iNOS-valku ja mRNA-d kopsus, maksas ning südames.

Eristav üksikasi on see, mis ei muutunud. IkB-alpha lagundamine, NF-kB fosforüülimine, STAT1 fosforüülimine ja kummagi faktori kogunemine tuuma jäid puutumata. Häire ilmnes üks etapp hiljem: tuumaekstraktides oli pärast lipopolüsahhariidi vähem NF-kB seondumist selle DNA-elemendiga ning pärast interferoon-gammat vähem STAT1 seondumist. Kromatiini immunosadestamine kinnitas, et rakkudes oli iNOS-i promootoril seotud vähem kumbagi faktorit. Vähenes ka tuumorinekroosifaktor alfa, mille promootor kasutab samuti NF-kB-d. Faktorid aktiveerusid ja jõudsid kohale, kuid seondusid oma siht-DNA-ga nõrgalt.

Pange tähele erinevust võrreldes signaalirajaga 1. See puudutab faktori seondumist DNA-ga, hõlmab STAT1, mitte STAT3, ning mõõdetavad näitajad on mRNA, valk ja nitrit, mitte ASC punktjad kogumikud ja kaspaas-1 fragmendid. Meie metüleensinise sihtmärkide kaart eri rakumudelites hoiab selle transkriptsioonitasandi lahus otsestest ensüümi- ja mitokondrimõõtmistest.

Signaalirada 3: seerumi IL-6 ja STAT3 aktiveerumine kudedes

IL-6 edastab signaali gp130 retseptoriperekonna kaudu Januse kinaasi ja STAT3 kaskaadi. Fosforüülitud STAT3 dimeriseerub, siseneb tuuma ja käivitab põletikulisi programme, samal ajal kui IL-6 ise on NF-kB sihtmärk. Seega moodustavad need kaks tagasisideahela, mida sageli nimetatakse IL-6–STAT3 teljeks. Tavapärased mõõdetavad näitajad on raja varasemas osas seerumi IL-6, fosforüülitud STAT3 ja kogu STAT3 suhe ning raja hilisemas osas efektorensüümid, näiteks iNOS ja COX2.

2023. aasta hiireuuringus IL-6 ja STAT3 kohta pärast lipopolüsahhariidi manustamist mõõdeti telge eri kehapiirkondades. Isastele C57BL/6 hiirtele manustati kolme päeva jooksul iga päev lipopolüsahhariidi 1 mg kg kohta ning 30 minutit pärast iga annust metüleensinist 5 või 10 mg kg kohta. Kolmandal päeval oli seerumi IL-6 mõlemas metüleensinise rühmas madalam kui ainult lipopolüsahhariidi saanud rühmas, samal ajal kui enamik teisi paneeli tsütokiine manustamise mõjul ei muutunud. Fosforüülitud STAT3 ja kogu STAT3 suhtarvud olid madalamad ajukoores, hipokampuses ja kõrvalesta nahas; lisaks oli vähem mikrogliia Iba-1 värvumist, vähem iNOS-i ja COX2 ning kaalulangus oli osaliselt leevenenud.

Siin tuleb arvestada kahe piiranguga. Madalam seerumi IL-6 koos väiksema STAT3 fosforüülimisega kudedes sobib telje moduleerimisega, kuid ei määra kindlaks esmast mõjutatud sõlmpunkti. Sama suhtarvu võivad anda nii väiksem tsütokiini hulk raja varasemas osas, nõrgem retseptori signaaliülekanne kui ka muutunud fosfataasiaktiivsus. Samuti on kehakaal kolme päeva jooksul ägeda stiimuli mõjul tervet looma iseloomustav näitaja, mitte sümptomite või remissiooni skoor. See lisab konteksti lisaks blotanalüüsile, muutmata signaaliülekande tulemust raviväiteks. Mitokondriaalsete redoksprotsesside eraldiseisev keemia toimib paralleelselt selle tsütokiine käsitleva mehhanismiga ning neid ei tohiks kokku sulatada.

Signaaliradade võrdlus: sekkumiskohad ja mõõdetavad näitajad

Tabel välistab kolm põhjendamatut järelduste ülekandmist. ASC punktjaid kogumikke puudutav tulemus ei tõenda STAT3-ga seotud tulemust. STAT1 seondumist iNOS-i promootoriga puudutav tulemus ei tõenda STAT3-ga seotud tulemust, kuigi mõlemad valgud kuuluvad STAT-perekonda. Seerumi IL-6 tulemus ei tõenda inflammasoomi kokkupaneku vähenemist: kõhukelmekatses vähenes IL-1beta, kuid IL-6 mitte. Iga rida vajab oma käivitajat ja mõõdetavat näitajat. Seetõttu tuleb metüleensinise raku-, looma- ja kliinilisi uuringuid lugedes siduda iga väide tasandiga, millel seda mõõdeti.

Miski sellest ei tõenda annustamist, ohutust ega kasu inimestele. Lipopolüsahhariidimudelid on kontrollitud käivitajad mehhanismi katsetamiseks, mitte krooniliste haiguste koopiad, ning ühendi manustamine koos käivitajaga katsetab esile kutsutud muutuse ennetamist, mitte väljakujunenud haiguse tagasipööramist. Hoidke see mehhanismide käsitlus lahus patsientide ravitulemustest ning hinnake iga terviseväidet selle aluseks oleva patsiendiuuringu põhjal.