Metüleensinine G6PD laboriuuringutes: mida värvaine tegelikult teeb

Üliõpilane vaatleb pärast inkubeerimist kaht katseklaasi. Ühes on tekkinud oodatud värvus. Teises mitte. Üliõpilane järeldab, et teisel patsiendil on glükoos-6-fosfaadi dehüdrogenaasi puudulikkus. See järeldus võib olla õige, kuid arutluskäigus jääb tähelepanuta põhimõte, millel test põhineb. Katseklaasis ei mõõdeta ensüümi otseselt. Mõõdetakse seda, mida ensüüm toodab, kasutades metüleensinist vahendajana.

Kui see kaudne seos on selge, ei tundu protseduur, kontrollproovid ega pikk ekslike tulemuste loetelu enam meelevaldsed.

Lühivastus

G6PD uuringus on metüleensinine redoksindikaator. Ensüüm G6PD toodab NADPH-d ning NADPH-st sõltuvad süsteemid redutseerivad sinise metüleensinise selle värvituks leukovormiks või kasutavad seda elektronide ülekandmiseks. Ensüümi normaalne aktiivsus tagab tõhusa redutseerumise. Puudulik aktiivsus põhjustab aeglast või mittetäielikku redutseerumist. See ongi kogu signaal.

Kahes ajaloolises meetodis kasutatakse sama värvainet, kuid nende lõpp-punktid erinevad. Kui neid eristada, kaob suurem osa segadusest.

Kaks testi, üks värvaine, erinevad lõpp-punktid

Esimene on metüleensinise otsese redutseerumise test, mida kirjeldasid Sass ja kolleegid ning hindas hiljem Gibbs. Siin on lõpp-punktiks värvaine ise: oksüdeeritud sinine metüleensinine redutseerub värvituks leukometüleensiniseks ning selle muutuse kiirus peegeldab NADPH tootmise võimekust. Esmane sõeluuringut käsitlev artikkel on leitav PubMedist Sassi jt (1966) nime all.

Teine on Breweri methemoglobiini redutseerumise test. Naatriumnitrit oksüdeerib kõigepealt hemoglobiini pruuniks methemoglobiiniks. Seejärel toimib metüleensinine elektronide ülekande vahendajana: redutseeritud metüleensinine annab redutseerivad ekvivalendid methemoglobiinile, muutes selle tagasi punaseks hemoglobiiniks. Seega on nähtav lõpp-punkt pruun versus punane, mitte sinine versus värvitu. Algne meetod avaldati ajakirjas Bulletin of the World Health Organization (Brewer jt, 1960).

Breweri uuringu nimetamine värvaine värvitustumise testiks on keemiliselt ebatäpne. Värvaine osaleb tsüklis; värvust muudab hemoglobiin. Allolev skeem näitab mõlemat reaktsioonirada.

Aluseks olev reaktsioon

G6PD katalüüsib pentoosfosfaadiraja esimest oksüdatiivset etappi:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Küpsete erütrotsüütide NADPH-varustus sõltub suuresti sellest rajast, nagu käsitletakse Luzzatto ja kolleegide ülevaates ajakirjas Blood (2020). NADPH hoiab glutatiooni redutseeritud kujul ja kaitseb rakku oksüdatiivse kahjustuse eest. Metüleensinine osaleb selles süsteemis elektronide vastuvõtjana. Piisav G6PD aktiivsus tagab piisava NADPH tootmise, mis omakorda tagab tõhusa redutseerumise. Madal G6PD aktiivsus katkestab ahela juba esimeses lülis.

Mõtle värvainest kui kütusenäidikust, mitte mootorist. See annab teavet NADPH kättesaadavuse kohta. Kõik muud tegurid, mis muudavad selle kättesaadavust või mõõtetulemust, võivad näitu muuta ilma ühegi muutuseta geenis.

Kuidas Breweri tüüpi protseduur toimub

Reagentide koostised on aastakümnete jooksul erinenud, seega ei tohi õppimiseks mõeldud kirjeldust pidada kliiniliseks protokolliks. Iga labor järgib oma valideeritud standardset tööprotseduuri. Seda hoiatust arvestades toimub klassikaline katseklaasiuuring järgmiselt, kasutades kolme katseklaasi ja 3-tunnist inkubeerimist, nagu on dokumenteeritud selles avaldatud teostuses:

1. Patsiendi katseklaas: täisveri koos glükoosi, naatriumnitriti ja metüleensinisega. Nitrit tekitab methemoglobiini, glükoos toetab erütrotsüütide ainevahetust ning värvaine võimaldab NADPH-st sõltuvat elektronide ülekannet.
2. Oksüdeeritud kontrollproov: veri koos nitriti ja glükoosiga, kuid ilma metüleensiniseta. See näitab pruuni methemoglobiini lõpp-punkti ehk puudulikkusele vastavat mustrit.
3. Hemoglobiini kontrollproov: veri koos veega. See näitab punase hemoglobiini lõpp-punkti ehk normaalset mustrit.
4. Inkubeeri kõiki katseklaase ligikaudu 37 C juures, tavaliselt 3 tundi, neid õrnalt segades.
5. Lahjenda igast katseklaasist väike alikvoot destilleeritud vees, et rakud lüüsida ja muuta värvuste võrdlemine selgemaks.
6. Võrdle patsiendi katseklaasi kahe kontrollprooviga. Värvuse muutumine tagasi punase suunas näitab märkimisväärset redutseerimisvõimet. Pruunika värvuse püsimine viitab väljendunud puudulikkusele.

Ühes ajaloolises koostises kasutati umbes 1 mL verd koos reagentidega, mille kontsentratsioonid olid ligikaudu 180 mM naatriumnitritit, 280 mM dekstroosi ja 0.4 mM metüleensinist. Käsitle neid arve kirjandusest pärineva näitena, mitte universaalse spetsifikatsioonina.

Tulemuse lugemine

Kvalitatiivne sõeluuring eristab kõige paremini aktiivsust ligikaudu 30 kuni 40 protsendi tasemel normaalsest aktiivsusest, nagu käsitletakse selles ajakirja Malaria Journal ülevaates G6PD puudulikkuse tuvastamise lünkadest. Normaalne sõeluuringutulemus tähendab seega, et uuring ei tuvastanud rasket puudulikkust. See ei kinnita täielikult normaalset aktiivsust.

Miks sõeluuring võib eksitada

Hemolüüsijärgne retikulotsütoos on klassikaline näiliselt normaalse tulemuse põhjus. Noortes erütrotsüütides ja retikulotsüütides on rohkem G6PD-d kui vanades rakkudes. Ägeda hemolüütilise episoodi ajal võivad vanimad ja kõige puudulikuma ensüümiaktiivsusega rakud olla juba hävinud, jättes alles noorte rakkude populatsiooni, mille aktiivsus osutub uuringus normaalseks. Sama bioloogiline nähtus eksitab ka kvantitatiivseid uuringuid, mitte ainult värvainepõhiseid sõeluuringuid.

Hiljutine vereülekanne varjab puudulikkust, sest doonori erütrotsüüdid lisavad proovile oma ensüümi. Mayo Clinic Laboratories nimetab vereülekannet üheks ebausaldusväärsete ensüümiuuringu tulemuste põhjuseks koos retikulotsütoosi ja leukotsüütide segava mõjuga.

Heterosügootsed naised on kõige keerulisem juhtum. X-kromosoomi juhuslik inaktiveerumine tekitab normaalsete ja puuduliku ensüümiaktiivsusega erütrotsüütide segu ning üldine aktiivsus võib jääda vahemikku raskest puudulikkusest näiliselt normaalseni. Kvalitatiivsetes sõeluuringutes jäävad vahepealsed fenotüübid sageli tuvastamata. WHO G6PD uuringute dokumentatsioon käsitleb seda piirangut üksikasjalikult.

Proovi vanus, säilitustemperatuur, visuaalse lõpp-punkti subjektiivsus, hematokrit ja reagentide kvaliteet lisavad nendele bioloogilistele mõjudele analüütilist müra.

Sõeluuring ei ole diagnoos

Puudulikule või vahepealsele aktiivsusele viitav või kliinilise pildiga vastuolus olev sõeluuringutulemus nõuab G6PD ensüümiaktiivsuse kvantitatiivset määramist. WHO peab võrdlusmeetodiks kontrollitud temperatuuril tehtavat kvantitatiivset spektrofotomeetriat. Selles uuringus lisatakse erütrotsüütide hemolüsaadile glükoos-6-fosfaati ja NADP+ ning tekkivat NADPH-d jälgitakse neelduvuse suurenemise kaudu lainepikkusel 340 nm. Muutuse kiirus on võrdeline ensüümi aktiivsusega, mis tavaliselt normaliseeritakse hemoglobiini suhtes ühikutena grammi kohta. Praegune kliiniliste laborite praktika on kokku võetud Mayo analüüsikataloogi G6PD aktiivsuse kirjes.

Tõlgendamisel kasutatakse labori valideeritud referentsvahemikku, mida väljendatakse sageli suhtena populatsiooni normaalsesse aktiivsusse; puudulikkust käsitletakse tavaliselt ligikaudu 30 protsendi läviväärtuse juures ning vahepealset aktiivsust sellest kõrgemal. WHO G6PD testide sihttooteprofiilid (2022) kirjeldavad seda diagnostilist raamistikku. Kui hiljutine hemolüüs või vereülekanne muudab fenotüpiseerimise ebausaldusväärseks, korratakse uuringut pärast erütrotsüütide populatsiooni tasakaalu taastumist; molekulaarsed uuringud võivad anda lisateavet, kuid ei asenda ensüümiaktiivsuse mõõtmist.

Piir, mida tasub hoida

Metüleensinine on nendes uuringutes ex vivo laborireagent. See on eraldi teema metüleensinise patsiendile manustamise ohutusest, mida käsitletakse metüleensinise vastunäidustuste juhendis. Biokeemia seob neid teemasid, sest ka ravim sõltub NADPH-st sõltuvast redutseerumisest, kuid värvaine katseklaasis ei ole annus vereringes. Lisateavet värvaine käitumise kohta värvimisainena teistsuguses keskkonnas leiad metüleensinisega värvimise põhimõtetest; selle keemilise rühma kohta aga labori redoksvärvainete käsitlusest.

Sõeluuring küsib, kas redutseerimisvõime näib säilinud olevat. Kinnitav uuring küsib, kui palju ensüümi tegelikult on. Värvaine vastab esimesele küsimusele hästi, eeldusel et keegi ei oota sellelt vastust teisele.