Metüleensinine biokilede vastu: mida valgusega aktiveeritud laboriuuringutes mõõdetakse

Biokile ei ole vedelikus hõljuv rakukogum. See on struktuur: pinnale kinnitunud rakud, mida ümbritseb nende endi moodustatud polüsahhariididest, valkudest ja rakuvälisest DNA-st koosnev maatriks ning milles hapniku ja toitainete sisaldus muutub väliskihist sisemusse liikudes. Just selle struktuuri tõttu võib ühend, mis tapab suspensioonis olevad bakterid minutitega, osutuda samade organismide vastu biokiles ebatõhusaks. Kõiki metüleensinist ja biokilesid puudutavaid väiteid tuleb tõlgendada seda struktuuri arvestades, sest maatriks määrab, kui palju värvainet jõuab rakkudeni ja kui palju valgust värvaineni.

See ülevaade käsitleb täpselt kolme allikat. Üks annab taustateavet. Kaks kirjeldavad laborikatseid. Nende rollide lahushoidmine ongi kogu lähenemise alus ning aitab vältida selle teema kõige levinumat viga: katseanumas saadud tulemuse esitamist justkui tõendina inimese infektsiooni ravimise kohta.

Taustaallikas käsitleb keemiat, mitte hävitamist

Neist kolmest vanim on 2005. aastal avaldatud narratiivne ülevaade fenotiasiinsete fotosensibilisaatorite arendamisest. See jälgib metüleensinise arengut 19. sajandi värvainest vähi fotodünaamilise ravi ning hiljem fotodünaamilise antimikroobse kemoteraapia juhtühendiks. Selle panus on struktuuri ja aktiivsuse seoste kirjeldamine: kromofoori metüülimine suurendab lipofiilsust, singlett-hapniku saagist ja fotobakteritsiidset toimet, aeglustades samal ajal redutseerumist vähem aktiivseks leukovormiks. Ülevaade sõnastab selgelt ka valdkonna probleemi. Enamikus töödes kasutati tavapäraseid kaubanduslikke värvaineid ning derivaatide arendamisega tegeleti suhteliselt vähe.

Kasuta seda ülevaadet oma mõttemudeli mehhanismiosa jaoks: valgus ergastab värvainet, triplettolekus toimub hapnikuga kas II tüüpi energiaülekanne, mis tekitab singlett-hapnikku, või I tüüpi elektronülekanne, mis tekitab radikaale. Just selle mitmetahulise rünnaku tõttu kaitsevad tavapärased resistentsusmehhanismid fotodünaamilise hävitamise eest halvasti. Ära viita sellele ülevaatele logaritmilise vähenemise tõendina. Seda seal ei mõõdetud. Mehhanismi laiem fotokeemiline taust on esitatud fotodünaamilise ravi tõendusmaterjali kogumikus ning lainepikkuse põhimõtteid, mis määravad, kas konkreetne lamp saab protsessi käivitada, käsitleb artikkel kuidas metüleensinine neelab punast valgust.

Kaks biokilekatset, kaks erinevat tulemusmõistet

Mõlemad katseartiklid uurivad metüleensinise fotodünaamilist toimet suuõõne biokiledele lainepikkusel 660 nm, kuid peaaegu kõiges muus on need erinevad. Erinevad kooslused, erinev vanus, erinevad värvainepreparaadid, erinevad valgusdoosid ja ennekõike erinevad tulemusnäitajad. See erinevus ongi käesoleva artikli keskne mõte ning allpool esitatud võrdlustabeli alus.

Esimene on 2024. aastal avaldatud küpset mitmeliigilist igemealust biokilet käsitlev in vitro uuring. Kolmkümmend kolm liiki kasvatati koos polüstüreenist tihvtidel Calgary Biofilm Device’i seadmes anaeroobsetes tingimustes. Sööde vahetati 72 tunni järel ja kasvatamist jätkati kavandatud 7 päevani. Töötluseks kasutati vaba metüleensinist kontsentratsioonil 0.01 protsenti ja 660 nm punast LED-valgust kiiritustihedusega umbes 330 mW ruutsentimeetri kohta 5 minuti vältel 2 mm kauguselt, mis annab arvutuslikult ligikaudu 99 J ruutsentimeetri kohta. Katse ülesehitus on selge nelja katserühmaga faktoriaalne skeem: töötlemata kontroll, värvaine ilma valguseta, valgus ilma värvaineta ning värvaine koos valgusega.

Teine on 2021. aastal avaldatud varajaste koloniseerijate suuõõne biokilet käsitlev in vitro uuring. Nelja Streptococcus’e liiki kasvatati koos 24 tundi 96 süvendiga plaatidel 1 protsendi sahharoosi juuresolekul. Fotosensibilisaator oli beeta-tsüklodekstriini nanoosakestega seotud metüleensinine kontsentratsioonil 4.65 mikromolaarset. Selle kandurpreparaadi eesmärk oli viia värvaine läbi biokile barjääride. Mõlemad valgusallikad kiirgasid punast valgust lainepikkusel 660 nm ning kokkupuude kestis 90 sekundit, kuid doosid erinesid järsult: laserrühmas 320 J ruutsentimeetri kohta ja LED-rühmas 8.1 J ruutsentimeetri kohta. Kontrollrühmad hõlmasid värvainet ilma valguseta, ainult laserit, ainult LED-valgust, füsioloogilist soolalahust negatiivse kontrollina ning 0.2 protsenti kloorheksidiini antimikroobse võrdlusalusena.

7 päeva vanune 33 liigist koosnev anaeroobne kooslus ning 24 tunni vanune 4 liigist koosnev varajaste koloniseerijate biokile on erinevad mõõtesüsteemid. Järgnevaid arvulisi tulemusi ei saa keskmistada.

Mida kummaski uuringus tegelikult mõõdeti

Küpse biokile uuringus olid tulemusnäitajateks metaboolne aktiivsus, mida hinnati TTC redutseerimise kaudu mõõtmisega lainepikkusel 485 nm, ning bakterite arvukus, mida hinnati ruudustikupõhise DNA-DNA hübridisatsiooniga 33 liigile vastavate proovide abil; avastamispiir oli ligikaudu 10,000 rakku. Eluvõimeliste mikroorganismide arvu külvimeetodil ei määratud, biomassi kristallvioletiga ei mõõdetud, elusate ja surnud rakkude kuvamist ei tehtud ning taastuvat kasvu ei jälgitud. Ainult LED-valgus vähendas metaboolset aktiivsust umbes 50 protsenti võrreldes LED-valguseta rühmadega ning värvaine koos LED-valgusega vähendas seda umbes 55 protsenti. Ainult värvainet saanud rühm kuulus statistiliselt töötlemata kontrolliga samasse rühma. DNA-põhise rakkude arvu puhul jäid ainult värvaine, ainult LED-valguse ning värvaine ja LED-valguse kombinatsiooni tulemused kõik kontrollist statistiliselt oluliselt madalamaks, kuid nende kolme vahel olulist erinevust ei olnud. Autorid sõnastavad järelduse otse: töötlused ei hävitanud väljakujunenud pinnale kinnitunud polümikroobset biokilet ning küps parodontaalne biokile vajab mehaanilist lõhkumist, millele fotodünaamiline töötlus saab olla kõige rohkem lisameetod.

Varajaste koloniseerijate uuringus oli tulemusnäitajaks selektiivsetel söötmetel kasvatamisega tuvastatud eluvõimeliste mikroorganismide arv, väljendatuna logaritmilisel skaalal. Valguseta värvainerühm ei erinenud soolalahuse rühmast. Mõlemad fotoaktiveeritud rühmad, laser koos kapseldatud värvainega ja LED-valgus koos kapseldatud värvainega, vähendasid eluvõimeliste mikroorganismide arvu negatiivse kontrolliga võrreldes kuni umbes 4 log võrra. Selle näitaja puhul tähendab see 10,000-kordset ehk 99.99-protsendilist vähenemist ning kumbki rühm ei erinenud statistiliselt kloorheksidiinist. Ainult valguse ja ainult pimedas kasutatud värvaine tulemusi ei esitatud eraldi usaldusväärsete logaritmiliste arvudena. Seetõttu on aus kokkuvõte see, mida artikkel toetab: fotoaktiveeritud kapseldatud värvaine tekitas vähenemise, pimedas kasutatud värvaine mitte ning mõju suurus vastas selle noore biokile mudelis antiseptilise võrdlusaine tulemusele.

Kumbki artikkel ei mõõtnud ravijärgset taastuvat kasvu, allesjäänud biomassi ega maatriksi struktuuri. CFU vähenemine ei ütle midagi allesjäänud maatriksi kohta. Metaboolse aktiivsuse langus ei ütle midagi ellujäänute kohta. DNA-põhine rakkude arv ei näita, millised rakud on elus.

Analüüsimeetodite ja tulemusnäitajate võrdlus

See tabel on artikli võrdlusmaterjal. Loe rida vasakult paremale, et näha, mida üks uuring tõendab, ning veergu ülevalt alla, et näha, millistele küsimustele kumbki uuring vastust ei anna.

Kolm erinevust väärivad rõhutamist. Esiteks selgitab küpses mudelis ainult valguse rühm peaaegu kogu metaboolset mõju, seega ei näita 55 protsenti värvaine vahendatud hävitamist. Teiseks on noores mudelis preparaat pimedas toimeta ning mõju ilmneb ainult valguse toimel, mis on fotoaktiveerimise tunnus. Kolmandaks vastaks DNA-põhise rakkude arvu 80-protsendiline langus matemaatiliselt ligikaudu 0.7 log vähenemisele ainult siis, kui mõõdetud muutuja oleks eluvõimeliste mikroorganismide arv. See ei ole aga nii, mistõttu ei tohi seda kunagi esitada logaritmilise hävitamisnäitajana. Seotud hambaravi biokilede taustateave on koondatud suuõõne biokilede ja hambaravi uuringute kogumikku ning üldist meetodit mudelite, manustamisviiside ja tulemusnäitajate eristamiseks eri uuringutes kirjeldab üksikasjalikult laborimeetodite juhend.

Miks biokileuuringud vajavad oma tõlgendamisreegleid

Neli muutujat määravad, kas metüleensinise biokileuuringu tulemus tähendab midagi ka väljaspool konkreetset katseplaati.

Esimesel kohal on biokile vanus ja maatriks. Vanemad biokiled on paksemad, rohkem ristsidemetega seotud ja värvainele raskemini läbitavad. 2021. aasta uuringu autorid nimetavad peamiste piirangutena värvaine tungimist biokilesse ja valguse halba levimist läbi organiseeritud biokile. Kandurstrateegiad, näiteks kapseldamine tsüklodekstriini, püüavad lahendada just seda piirangut. Seetõttu on preparaadi koostis katsemuutuja, mitte pisiasi.

Teisel kohal on doosi arvutus. Energiatiheduse väärtused erinevad siin peaaegu neljakümnekordselt, ulatudes samal lainepikkusel 8.1 kuni 320 J-ni ruutsentimeetri kohta, ning kiiritustihedus ulatub 90 mW-st mitme W-ni ruutsentimeetri kohta. Sama lainepikkus ei tähenda sama kokkupuudet ning kumbki uuring ei varieeri doosi piisavalt süstemaatiliselt, et määrata doosikõverat.

Kolmandal kohal on kontrollrühmad. Uuring, kus puudub pimedas kasutatud värvaine rühm, ei saa välistada värvaine enda toksilisust. Uuring, kus puudub ainult valguse rühm, ei saa omistada mõju fotoaktiveerimisele. Mõlemad artiklid sisaldavad mõlemat kontrolli, mis on nende tugevus. Küpse biokile artikkel näitab, miks ainult valguse rühm on oluline: ilma selleta näiks metaboolne tulemus värvaine mõjuna.

Neljandal kohal on tulemusnäitajad. Eluvõimelisus, ainevahetus, DNA hulk, biomass, struktuur ja taastuv kasv on kuus erinevat väidet. Ükski siin käsitletud artikkel ei mõõda neist rohkem kui kahte. Eelkõige puudub kõikjal taastuva kasvu mõõtmine, seega on mõju püsivus mõõtmata, mitte tõendatud.

Mida see ei tõenda infektsiooni ravimise kohta

Üheski neist katsesüsteemidest ei ole vereringet, immuunrakke, süljevoolu, igemevao vedeliku vahetumist ega mehaanilist puhastamist. Värvaine kontsentratsioon süvendis ei ole sama mis kontsentratsioon koes pärast mis tahes manustamist inimesele. Ühekordne 5 minuti või 90 sekundi pikkune kokkupuude noore või isegi küpse laboratoorse biokilega ei ole ravikuur. Küpse biokile uuringu autorid ütlevad seda ka ise, käsitledes fotodünaamilist töötlust võimaliku lisameetodina mehaanilisele eemaldamisele, mitte iseseisva hävitamismeetodina.

Õige kokkuvõte on kitsalt piiritletud ja kindlalt põhjendatud. Fotoaktiveeritud metüleensinine võib pärssida ainevahetust ja vähendada DNA-põhist arvukust küpses laboratoorses suuõõne koosluses seda hävitamata, kusjuures selles katses selgitab enamiku metaboolsest mõjust valgus üksi. Fotoaktiveeritud tsüklodekstriini abil kantav värvaine võib vähendada eluvõimeliste mikroorganismide arvu noores laboratoorses streptokokkide biokiles mitme suurusjärgu võrra, samas mudelis kloorheksidiiniga võrreldaval määral. Kas kumbki tähelepanek kehtib ka inimese infektsiooni puhul, sõltub värvaine kohaletoimetamisest, valguse ligipääsust, hapnikust, anatoomiast ja kliinilistest tulemusnäitajatest, mille mõõtmiseks neid katseid ei kavandatud.