Metüleensinine ja ALS: miks tulemused katsemudelites erinevad

Kui otsite teavet metüleensinise ja ALS-i kohta, leiate kaks väidet, mis näivad teineteisele vastu rääkivat. Üks ütleb, et sinine värvaine kaitses ALS-i mudelites neuroneid. Teine ütleb, et ALS-i hiiremudelis polnud sellest kasu. Mõlemad väited viitavad päriselt avaldatud teadusartiklitele ning mõlemat artiklit tasub tõsiselt võtta. Vastuolu kaob, kui sõnastada kummagi katse aluseks olev põhimõte: mudel määrab, mida saab väita.

Ussil saadud tulemus lubab teha väite ussi kohta. Kalavastsel saadud tulemus lubab teha väite kalavastse kohta. Kumbki ei luba teha väidet patsiendi kohta enne, kui seda toetavad imetaja haiguse kulu andmed. See artikkel võrdleb kõrvuti kaht enim viidatud teadusartiklit, et näidata, miks nende vastused erinevad.

Kaks katset ühes tabelis

Hoidke seda tabelit lugemise ajal silme ees. Kõik uuringute olulised erinevused mahuvad siia.

Geneetika erineb, liigid erinevad, manustamisviis erineb, ajastus erineb ja tulemusnäitajad erinevad. Genotüüp on vaid üks viiest erinevusest, seega ei saa see uuringupaar tõendada, et metüleensinine toimib valikuliselt ühele ALS-i mehhanismile. See tõendab midagi kitsamat, kuid siiski kasulikku: lihtsates mudelites varajase otsese kokkupuute korral nähtud tugev taastav toime ei kandunud üle imetaja haiguse kulule pikaajalise suukaudse manustamise korral.

Positiivne tulemus: mida ussi- ja kalauuring näitas

2012. aasta ussi- ja kalauuringus ekspresseeriti usside motoneuronites mutantset inimese TDP-43 või FUS-i ning kalaembrüotesse süstiti mutantset inimese mRNA-d. Need on proteotoksilisuse mudelid. Need jäljendavad mutantse valgu toksilist mõju liikumisele ja neuronite kujule päevade jooksul, mitte täiskasvanud inimese ALS-i kogu kulgu aastate jooksul.

Raviga alustati väga vara. Ussid kasvasid koorumisest alates metüleensinist sisaldaval agaril. Kalaembrüod viibisid üleöö ravimilahuses alates 24 tunni möödumisest viljastamisest ning nende käitumist testiti ligikaudu kaks päeva hiljem. Ravimi ja neuroni vahel ei olnud hematoentsefaalbarjääri sellisel kujul nagu imetajal ning ravimi sisaldust plasmas ega ajus ei mõõdetud.

Nendes tingimustes olid mõjud suured ja järjepidevad. Nii 6 kui ka 60 μM vähendasid TDP-43 ja FUS-i ussidel vanusest sõltuvat halvatust. Täiskasvanuea 12. päeval oli halvatud ligikaudu 80 protsenti ravimata TDP-43 ussidest, võrreldes umbes 10 protsendiga koorumisest alates ravitud ussidest. Sünaptilise talitluse test osutas samas suunas: TDP-43 ussid olid ülitundlikud aldikarbi suhtes, mida kasutatakse neuromuskulaarse ülekande uurimiseks, ning metüleensinine nihutas vastuse normaalse suunas. Degeneeruvate motoneuronijätkete arv vähenes, kusjuures kõige selgem mõju ilmnes 60 μM juures. Kaladel paranes puudutusega esile kutsutud ujumine märgatavalt ning lühenenud motoorsed aksonid kasvasid 30 või 60 μM juures normaalse pikkuse suunas, kuigi taastumine oli osaline, mitte täielik.

Oksüdatiivse stressi andmed sobisid antioksüdatiivse toime tõlgendusega. Mutantsetel ussidel ja kaladel olid reaktiivsete hapnikuühendite näitajad suurenenud ning vähenesid ravi mõjul. Metüleensinist saanud normaalsed ussid elasid prooksüdatiivse koormuse korral palju kauem kui ravimata ussid. Olulised on aga kaks piirangut. Mutantsete TDP-43 ja FUS-i valkude kogutasemed ei vähenenud ning uuringus ei mõõdetud otseselt valguagregaatide hulka. Seega näitab uuring funktsiooni taastumist, kuid ei tõenda agregaatide eemaldamist. Kõigil, kes jälgivad, kuidas redoks- ja mitokondriaalseid hüpoteese tavaliselt sõnastatakse, tasub pidada seda mehhanismi toetatuks, kuid mitte lõplikult kindlaks tehtuks.

Kõige õpetlikum detail oli ajastus. Kui autorid ootasid ravi alustamisega täiskasvanuea 5. päevani, oli 12. päeva halvatuse määr umbes 55 protsenti, mitte umbes 10 protsenti nagu koorumisest alates ravi saanud ussidel. Sama ravim, sama uss, sama mutatsioon, kuid palju väiksem mõju. Suur osa näilisest kasust tulenes varajasest ennetavast kokkupuutest.

Nulltulemus: mida SOD1 hiireuuring näitas

2011. aasta hiireuuringus esitati keerulisem küsimus rangemas katsesüsteemis. Kongeneetiliste SOD1 G93A hiirte haigus kulgeb tagajäsemete värinast kõnnakuhäirete ja püstum refleksi kadumise kaudu eelnevalt määratletud lõpp-punktini. Ravi algas enne sümptomite teket 45. päeval ja jätkus iga päev, kusjuures vaatlejad hindasid neuroloogilist seisundit skaalal 0 kuni 6. See katse hõlmab kogu haiguse kulgu, mistõttu on see patsiendile olulistele küsimustele lähemal kui mis tahes usside halvatuse kõver.

Peamised tulemused ei näidanud mõju. Haiguse üldine algus saabus kontrollrühmas 121 päeva vanuses, metüleensinise rühmas aga 124 päeva vanuses; erinevus ei olnud statistiliselt oluline. Elulemus lõppstaadiumini oli vastavalt 167 päeva ja 170 päeva, samuti statistiliselt olulise erinevuseta. Mõned teisesed analüüsid soosisid ravi: emastel hilines haiguse algus umbes 7 päeva ning ravitud loomad veetsid mõnevõrra rohkem aega kergemates ja vähem aega rasketes staadiumides. Väikeste soopõhiste alarühmade ja arvukate staadiumivõrdluste tõttu sobivad need leiud pigem hüpoteeside püstitamiseks kui tõendiks. Neuronite arvu ei määratud, SOD1 agregatsiooni ei testitud ning oksüdatiivseid ega põletikumarkereid ei mõõdetud. Seetõttu ei saa uuring ka öelda, kas ravim jõudis oma sihtmärkideni ega toiminud või ei mõjutanud neid selle annuse juures üldse. Testiti ainult üht annust.

Autorid ise tõid välja kõige olulisema piirangu, mis kehtib mõlemas suunas. Suure koopiate arvuga SOD1 G93A modelleerib hästi toksilisest SOD1-st tingitud haigust, kuid SOD1-ga seotud haigus moodustab vaid väikese osa perekondlikust ALS-ist ning selle bioloogia erineb enamikust sporaadilistest juhtudest. Nad soovitasid kandidaataineid uuesti testida TDP-43-põhistes imetajamudelites. See soovitus on hiljem muutunud keerulisemaks, sest ussi- ja kalauuringu autorid märgivad, et ka eraldi TDP-43 hiireuuringus ei parandanud metüleensinine motoorseid tulemusnäitajaid. Seega võib ühend näidata ühes TDP-43 süsteemis tugevat mõju, kuid teises TDP-43 süsteemis mitte mingit mõju. Katsesüsteem on sama oluline kui geen.

Miks paranemine ussil või kalal ei tõenda kasu patsientidele

Mõelge igast mudelist kui vastusest eri küsimusele.

Esiteks erineb bioloogia. TDP-43 ja FUS on nukleiinhappeid siduvad valgud, millel on neis lihtsates süsteemides ühiseid geneetilisi koostoimeid, samas kui SOD1 toksilisus toimib osaliselt teistsuguste esmaste mehhanismide kaudu. Ravim, mis leevendab üht proteotoksilist stressi, ei pruugi leevendada teist. Samuti ei pruugi edu embrüonaalse üleekspressiooni korral ennustada edu täiskasvanuea aeglase neurodegeneratsiooni puhul, millega kaasnevad põletik, gliiarakkude osalus ja organismi üldine halvenemine.

Teiseks erineb kokkupuude ainega. Pidev kokkupuude mikromolaarse kontsentratsiooniga lahuses ei ole sama mis suukaudne manustamine. Allaneelatud annuse ja seljaaju motoneuroni vahele jäävad imendumine soolestikust, esmase passaaži metabolism, seondumine plasmavalkudega, ajju tungimine ja kliirens. Kumbki uuring ei mõõtnud ravimi sisaldust närvisüsteemis, seega ei saa kumbki seostada enda kasutatud kontsentratsiooni teise uuringu omaga.

Kolmandaks erineb ajastus. Ussidel ja kaladel nähtud kasu sõltus suuresti ravist enne patoloogiliste muutuste kuhjumist. Ka hiirte ravi algas enne sümptomite teket, mis on uuringu tugevus, kuid inimestel algaks ravi peaaegu alati pärast sümptomite ilmnemist ehk veel hiljem. Ennetavale toimele viitav leid kahepäevases embrüokatses on uurimistöö lähtepunkt, mitte kliinilise kasutuse mudel.

Neljandaks erinevad tulemusnäitajad. Halvatus 12 päeva vanuses, aldikarbitundlikkus, aksoni pikkus mikromeetrites ja ujumisdistants on vahetud fenotüübilised näitajad. Haiguse algus ja elulemus imetajal peegeldavad kõigi organismi kompenseerivate ja kulgu keerukamaks muutvate protsesside koosmõju. Ravimid muudavad sageli vahetuid näitajaid, ilma et muudaksid elulemust. Just seetõttu kasutatakse imetajauuringutes tulemusnäitajana aega kindla sündmuseni.

Lugejad, kes soovivad järgmise pealkirja hindamiseks kontrollnimekirja, võivad kasutada artiklit kuidas lugeda prekliinilisi uuringuid: küsige, millist liiki ja transgeeni kasutati, milline oli annus ja manustamisviis, kas ravimi sisaldust mõõdeti, millal ravi patoloogiliste muutuste suhtes alustati, kas tulemusnäitaja oli lühiajaline fenotüüp või haiguse kulg ning kas mõju kordus teises laboris. Metüleensinise laiem inimuuringute tõendusmaterjal on endiselt õige koht kontrollimaks, kas mõnest neist varajastest leidudest on kujunenud kliinilised andmed.

Mida see tähendab patsientidele ja peredele

Nendest teadusartiklitest ei tulene ühtki väljakujunenud metüleensinise raviskeemi ALS-i jaoks. Positiivne uuring toetab oksüdatiivsete ja sünaptiliste mehhanismide edasist uurimist TDP-43 ja FUS-i bioloogias. Nulltulemusega uuring ei toeta ootust, et pikaajaline suukaudne manustamine sellise kokkupuute juures muudaks SOD1-tüüpi haiguse kulgu. Koos kirjeldavad need mudelitevahelist tulemuste ebaühtlust, mitte ravisoovitust.

Ohutust tuleb käsitleda sama kainelt kui tõhusust. ALS-i hiireuuringud ei ütle midagi ohutu annustamise kohta inimestel ning metüleensinisega kaasnevad reaalsed riskid: hemolüüs G6PD puudulikkuse korral ja serotoniinitoksilisus kooskasutamisel serotonergiliste ravimitega. Võimalik G6PD puudulikkus, antidepressantide praegune kasutamine ja iga kavandatav ravimimuutus tuleb läbi arutada arstiga. Enne laboriuuringute pealkirjade põhjal tegutsemist tuleb üle vaadata ka metüleensinise üldised ohutusandmed.

Põhijäreldus mahub ühte lausesse. Varajase kokkupuute korral parandas metüleensinine tugevalt TDP-43 ja FUS-i usside ning kalavastsete fenotüübilisi näitajaid, kuid pikaajalise suukaudse manustamisega SOD1 hiireuuringus ei toonud see sisuliselt kasu haiguse alguse ega elulemuse seisukohalt, seega on aus tõlgendus mudelist sõltuv tõendusmaterjal, mis ei toeta kasutamist patsientidel.