Kes töötas välja lilla verevärvingu? Metüleensinine, Malachowski, Romanowsky ja Giemsa

Eosiin on punane. Metüleensinine on sinine. Segage need kokku, kandke segu kuivatatud vereäigele ja mõned äige osad värvuvad lillaks.

Mitte kõik osad. Heas preparaadis muutuvad valgevereliblede tuumad punakaslillaks ning malaariaparasiidi sees omandab kromatiin sama värvuse, samal ajal kui ümbritsevad punaverelibled jäävad roosaks ja tsütoplasma hallikassiniseks. Just lilla värvus võimaldab rakutüüpe üksteisest eristada.

Kumbki pudel ei sisalda lillat. See värvus tekib alles siis, kui metüleensinise konkreetne laguprodukt kohtub alusklaasil eosiiniga. 1880. ja 1890. aastatel ei teadnud keegi selle laguprodukti olemasolust, rääkimata selle olemusest. Värvuse jälile püüdnud inimesed töötasid üksinda ebapuhaste värvainetega, ilma usaldusväärse võimaluseta teada saada, mida sisaldab pudel, mis on kaks kuud riiulil seisnud.

Seepärast on pealkirjas esitatud küsimusel rohkem kui üks põhjendatav vastus ning seepärast muutus vastus 2011. aastal.

Koos seguga muutunud nähtav teave

Värvingut ei leiutatud ühe korraga. See kujunes järk-järgult. Iga muudatus segus tõi nähtavale täpselt ühe uue infokillu ning nende infokildude järgnevus annab ajaloost kõige selgema ülevaate.

Oluline on viimases veerus nähtav muster. Iga edusamm avardas värvigammat ning iga laienemine muutis nähtavaks veel ühe struktuuri. Lilla pole selle meetodi juures kaunistus; sellest sõltub, kas näeme üksnes parasiidi olemasolu või ka seda, millest ta koosneb. See, kuidas värvaine ise BASF-i värvitehasest meditsiini jõudis, on pikem lugu, millel on oma dokumendid. Kogu ülaltoodud sündmuste jada koos iga kirje allikaga on esitatud allikaviidetega panustajate ajajoonel.

Joonis: samad kuus segu kujutatuna selle järgi, mis oli nõus ja mis sellest välja tuli. Ringid tähistavad värvaineid; nende all olevad plokid värvusi, mida need värvained võisid vereäiges tekitada. Enne 1890. aastat ei ole ühtki punakaslillat plokki ning pärast seda ei puudu see ühestki segust.

Mees, kes kasutas booraksit sihilikult

Ernst Malachowski oli arst Breslaus, tänapäeva Wrocławis. Ta töötas kogu oma karjääri erapraksises ja väikeses kliinikus, mida pidas koos kolleegiga, ning tegi laboritööd oma vabast ajast. Ta sündis Strzelnos 12. märtsil 1857, õppis Breslau ülikoolis arstiteadust ning töötas aastatel 1882–1887 sisehaiguste assistendina Kõigi Pühakute haiglas, mis oli tollal Saksamaa suuruselt teine haigla.

1888. aastal alustas ta Chęciński ja Plehni topeltvärvinguga. Ühes 1889. aastal valmistatud preparaadis nägi ta, et plasmoodiumi tuuma kromatiin värvus tsütoplasmast erinevalt, kuid leidis siis, et ei suutnud tulemust korrata. Ta proovis metüleensinist hapestada, mis tegi asja hullemaks. Ta proovis seda booraksiga aluseliseks muuta, mis toimis iga kord. Ta demonstreeris meetodit avalikult 15. juunil 1890 ning avaldas 1891. aasta augustis põhjalikuma kirjelduse, sealhulgas juhise booraksi kasutamiseks. Ta märkis, et värvimine kestis kakskümmend neli tundi ja tulemusi oli lihtne korrata.

Kakskümmend neli tundi on diagnostikalaboris pikk aeg ning tema artikkel ei käsitlenud parasiidi tuuma lillakaspunast värvust pikemalt. Mis tahes põhjusel ei võtnud keegi metüleensinise sihilikku aluseliseks muutmist kasutusele enne, kui Nocht seda 1898. aastal uuesti tegi. Malachowski ei kirjutanud verevärvimisest enam kunagi.

Põhjus, miks temast oli kuni viimase ajani nii vähe teada, peitub arhiivides, mitte mingis mõistatuses. Meditsiinikirjandusse jäi tema elust peaaegu jäljetu lünk ning säilinud materjal jõudis meieni ühtainsat teed pidi. Tema tütar Marie lahkus 1939. aastal Saksamaalt Londonisse, teenis Briti armees ja asus elama Kanadasse ning tema perekonnapaberite kogu jõudis lõpuks New Yorgi Leo Baecki instituuti. Tema vend Leo hukkus Esimeses maailmasõjas. Tema õde Eva küüditati 1942. aasta aprillis Breslaust Izbica transiitlaagrisse ega tulnud enam tagasi. Tema ema Hedwig võttis endalt elu 22. aprillil 1942, et mitte jääda ootama samasugust küüditamist. Malachowski oli surnud 1934. aastal, enne kõiki neid sündmusi.

Nii lõppevale perekonnaloole lakatakse viitamast. Kaks artiklit, mis tõid Malachowski tagasi värvingu kujunemisloosse ja ilmusid mõlemad 2011. aastal, koostati Poznańi ja Wrocławi arhiividokumentide ning Marie New Yorgis säilitatavate paberite põhjal.

Hallitanud pudel ja õnneliku juhusega venelane

Dmitri Romanowsky õppis Peterburi sõjameditsiiniakadeemias arstiteadust ja tegeles malaariaga suurema osa oma karjäärist. 1890. aastal avaldas ta meetodi, mis oli paberil peaaegu identne Chęciński omaga: muutmata metüleensinine ja eosiin, ainult veidi rohkema eosiiniga.

1891. aasta septembris avaldas ta meetodi, mis tegi ta kuulsaks, ning oluline üksikasi oli peidetud juhistesse. Tema parimad tulemused pärinesid die vorräthige Methylenlösung'ist ehk metüleensinise varulahusest, mis oli seisnud üle kahe kuu ja mille pinnal kasvas hallitus. Hallitus ja seismisaeg olid värvainet osaliselt demetüülinud. Romanowsky ei teadnud seda ega suutnud protsessi kontrollida ning teised tema meetodit proovinud uurijad ei saanud lillat värvust. Tema väitekiri oli Peterburis esitatud 1891. aasta juunis, mistõttu tavakäsitlus peab avastuse aastaks 1891. aastat.

Malachowski demonstratsioon oli toimunud 1890. aasta juunis, üle aasta varem, ning tema meetod andis soovitud tulemuse sihilikult.

Miks sai värving nime vale mehe järgi

Malachowski kasuks kõnelevad tõendid koondasid Kristine Krafts, Ernst Hempelmann ja Barbara Oleksyn ning nende argument toetub neljale asjaolule. Avaliku demonstratsiooni kuupäev: juuni 1890 võrreldes septembriga 1891. Sõna sihilik võrreldes sõnaga juhuslik. Asjaolu, et Malachowski avaldas oma meetodi koos booraksi kasutamisega, samal ajal kui Romanowsky meetod sõltus kontrollimatust muutujast. Ning tähelepanek, et plasmoodiumi tuuma kirjeldus koos seda nähtavaks teinud lilla värvusega kadus kirjandusest sisuliselt seitsmeks aastaks, sest keegi ei suutnud juhuslikku tulemust korrata.

Nad sõnastavad oma järelduse otsekoheselt. Eluloolises artiklis nimetavad nad au omistamist „moonutuseks” ning tsiteerivad Ralph Lilliet, kes kirjutas 1978. aastal, et „võib-olla peaksime nimetama seda värvingute perekonda Malachowski värvinguteks”.

Väide on vaidlustatud, nagu prioriteediväited tavaliselt, ning vaidluse olemust tasub pigem selgitada kui seda lahendada. Prioriteedivaidluses tuleb määratleda, milles avastus seisnes. Kui avastus on lilla värvus, kuulub varasem dokumenteeritud demonstratsioon Malachowskile. Kui avastus on avaldatud meetod, avaldasid mõlemad mehed selle 1891. aastal ning nimeandjaks sai Romanowsky. Kui avastus on selgitus, pole kummalgi õigust seda enda omaks pidada, sest kumbki ei teadnud, et valmimine tähendas demetüülimist, ega osanud öelda, miks värvus üldse tekkis. Just selle viimase asjaolu jätavad populaarsed käsitlused vahele. Toimiv koostisosa oli lisand, mida keegi polnud tuvastanud, ning esimene inimene, kes tekitas värvuse sihilikult, tegi seda korratava empiirilise retsepti järgi, mitte retsepti toime mõistmise põhjal.

Kaks 2011. aasta artiklit on kõige põhjalikum avaldatud käsitlus Malachowski kasuks kõnelevatest tõenditest ning mõlemad on PubMedis tasuta loetavad: pikk ülevaade kirjena PMID 21235291 ja elulooline artikkel kirjena PMID 21660627. Ülevaate PubMedi kirje sisaldab ka viidet selle kommentaarile, mis ilmus samas ajakirjas hiljem samal aastal asukohaga 86(5):366. See tuletab õigustatult meelde, et argument vaidlustati trükis kohe pärast ilmumist.

Vaidlus ei puuduta keemiat. Kõik asjaosalised on ühel meelel selles, mis lilla värvus on ja millised komponendid selle tekitavad. Lahkarvamus puudutab seda, kes jõudis selleni esimesena, ning seda, kas juhuslik tulemus, mida keegi korrata ei suutnud, üldse loeb selleni jõudmisena.

Mida hilisemad nimed juurde andsid

Kui Malachowski tekitas lilla värvuse esimesena, miks kannab värving Romanowsky, Wrighti ja Giemsa nime?

Sest värvisegu, mis töötab ühe korra oma leiutaja käes, pole veel reagent. Hilisem töö muutis tujukalt käituva segu millekski, mida teises riigis töötav laborant võis tavalisel teisipäeval kasutada.

Nocht jõudis selleni arutluse teel. Kui ta ei suutnud lihtsa neutraalse värvainega usaldusväärset tulemust saada, järeldas ta, et lilla peab pärinema millestki metüleensinises, mis ei ole metüleensinine, ning asus seda otsima. Unna oli juba märganud, et vananenud metüleensinise lahused värvisid nuumrakkude graanulid punaseks, ning pakkunud välja, et värvaine valmimisel tekib uus aine. Bernthsen oli 1885. aastal näidanud, et aluselistes tingimustes eralduvad metüleensinisest metüülrühmad ning tekivad ühendid, mida tänapäeval nimetame asuurideks. Nocht ekstraheeris aktiivse fraktsiooni kloroformiga ja oskas nimetada seda vaid Rot aus Methylenblau'ks ehk metüleensinisest saadud punaseks; Michaelis nimetas selle 1901. aastal azure I-ks. Jenner lahendas praktilise valmistamise ja kasutamise küsimused. Metüleensinise ja eosiini sademe taaslahustamine absoluutses metanoolis andis ühe stabiilse lahuse, mis fikseeris äige värvimise ajal ja kõrvaldas vajaduse kuumfikseerimise järele. Leishman ja Reuter ühendasid polükroomseks muudetud värvaine alkohoolse lahustiga ning said korraga nii stabiilsuse kui ka lilla värvuse. Wright asendas kaheteisttunnise inkubeerimise 65 °C juures ja kümnepäevase seismise ühe tunniga voolavas aurus. Giemsa loobus täielikult juhuslikult valminud lahusele toetumisest, kasutades teadaolevate värvainete mõõdetud koguseid ning lisades metanoolile glütserooli, et toode taluks troopilist kuumust. Ta ei avaldanud kunagi, kuidas ta puhast metüleenasuuri valmistas. Ta müüs seda dr Grübleri laborile Leipzigis, mis turustas seda azure I nime all ning väitis, et ainult nende versioon on ehtne Giemsa värvisegu.

Selle asuuri koostise üle vaieldakse endiselt. Mõned arvavad, et see oli lihtsalt polükroomseks muudetud metüleensinine, teised, et see sisaldas rohkesti Azure B-d. Vastus tuli sõja tõttu. Kui Saksa värvained muutusid kättesaamatuks, leidis Ameerika Ühendriikide rahvaterviseteenistuse meeskond — Ralph Lillie koos Maurice Roe ja Aimee Wilcoxiga —, et parima värvingu andsid kolm eraldatud komponenti: muutmata metüleensinine, selle demetüülitud laguprodukt Azure B ja eosiin. Azure B asendas kättesaamatut azure I-d ning need kolm komponenti on endiselt tänapäeval malaaria diagnoosimiseks kasutatava värvingu alus.

See, kuidas need kolm komponenti alusklaasil keemiliselt vastastikku toimivad, on eraldi küsimus ja teise lehe teema. Romanowsky tüüpi värvingute värvainete rollide ja keemia käsitlus selgitab, mida Azure B ja eosiin kumbki teevad ning miks nende paar tekitab värvuse, mida kumbki eraldi ei anna. Mikroskoopia ja laborirakenduste leht käsitleb praktilist poolt: mida konkreetne preparaat näitab ja kuidas hinnata, kas mõni toode sobib meetodile, mida kavatsete kasutada.

Ajaloo osa, mis on endiselt aktuaalne

Üks selle loo üksikasi ei lakanud kehtimast 1902. aastal. Ligikaudu viiskümmend aastat oli maailma tavapärase malaariavärvisegu tähtsaim komponent nimetu lisand. See oli segus juhuslikult, selle kogus varieerus pudeliti, selle koostis oli osa sellest ajast ärisaladus ning selle osakaalu üle vaieldi kuni 1940. aastateni. Värvisegu kasutajad ei olnud hooletud. Neil polnud võimalust teada, mis pudelis oli.

Sama probleemi tänapäevane versioon on spetsifikatsioon, mis kirjeldab ainult osa materjalist. USP nõuetele vastavus on tee turul pakutava kõrgeima puhtuseni, sest see on täielik avaldatud standard, mitte üksik mõõtmine: identsus, puhtus, orgaanilised lisandid, sealhulgas asuurvärvained, lahustijäägid, elementlisandid, kuumutusjääk, mikrobioloogilised piirmäärad ja bakteriaalsed endotoksiinid. Blupreme hangib oma metüleensinise ravimitootjalt ning avaldab täieliku analüüsisertifikaadi, nii et selle loendi iga rida saab kontrollida, selle asemel et piirduda väidetega. Sertifikaat, mis esitab raskmetallide analüüsi tulemuse ja nimetab seda USP nõuetele vastavuseks, on tänapäevane vaste pudelile sildiga „valminud metüleensinine”: võimalik, et hea reagent, kuid silt ei ütle, mis selles on.