E. coli ja teiste bakterite kolooniate välimuse tõlgendamine EMB-agaril

Üliõpilane külvab tundmatu mikroorganismi triipkülvina eosiin-metüleensinise agarile, inkubeerib seda üleöö ja leiab järgmisel päeval plaadilt roheliselt helkivad tumedad kolooniad. Laboripäevikusse kirjutatakse „E. coli, kinnitatud”. See sissekanne väidab rohkem, kui plaat võimaldab järeldada. Plaat näitab kasvu- ja kääritamisfenotüüpi kindlates tingimustes. Liigiline kuuluvus on eraldi väide, mis vajab eraldi tõendeid.

See juhend käsitleb EMB-agari tulemusi tõlgendamisülesandena. See selgitab meetodi aluspõhimõtet, tutvustab kontrollidega illustratiivset plaadiatlast ja toob välja olukorrad, kus õpikupilt võib eksitada.

Plaadi aluspõhimõte

EMB-agar on nii selektiivne kui ka diferentsiaalne sööde. Värvained eosiin Y ja metüleensinine pärsivad paljusid grampositiivseid organisme, mistõttu sööde soosib gramnegatiivsete organismide kasvu. Samad värvained toimivad indikaatoritena: kui organism kääritab olemasolevat suhkrut ja tekitab kohapeal piisavalt hapet, seob koloonia rohkelt värvainet ning muutub tumelillaks kuni sinakasmustaks. Intensiivse happetootmise korral võib koloonia pinnal ilmneda metallroheline küütlev läige. ASM-i eosiin-metüleensinise agarplaatide protokoll kirjeldab selektiivsuse ja eristamise kombinatsiooni ning sisaldab õppetööks võrdlusfotosid.

Enne tulemuste tõlgendamist on oluline üks detail: kontrolli, millist koostist kasutatakse. Vanem Holt Harris Teague'i koostis sisaldab laktoosi ja sahharoosi, Levine'i EMB aga ainult laktoosi. Organism, mis kääritab sahharoosi, kuid mitte laktoosi, näiteks paljud Serratia marcescens'i isolaadid, võib neil kahel versioonil välja näha erinev. EMB-söötmete tootja dokumentatsioon toob selle koostise erinevuse selgelt välja. Märgi laboripäevikusse tulemuse kõrvale ka tootja ja söötme koostis.

Valmis külvamata EMB-agar on tavaliselt punakaspruun kuni punakaslilla, vahel roheka varjundi või peene sademega. See taustavärvus ei ole kasv. Võrdle iga tulemust külvamata plaadi või dokumenteeritud lähtevälimusega ning hinda esmast külviplaati pärast ligikaudu 18 kuni 24 tundi aeroobset inkubeerimist temperatuuril 35 kuni 37 C, kui õppeprotokoll ei näe ette teisiti. Pikem inkubeerimine võib muuta kääritamisega seotud välimust.

Kuidas plaati vaadelda

Kasuta kahte tüüpi valgust. Esmalt vaata plaati peegeldunud või kaldvalguses ja kalluta seda: metalliläige on küütlev ning võib vaatenurga muutudes ilmuda või kaduda. Seejärel vaata plaati läbivas valguses, et hinnata kolooniate värvust ja tumedaid keskosi. Lähtu hästi eraldatud kolooniatest, sest tihe kasv ja naaberkolooniad muudavad happe kohalikku kogunemist ning võivad värvust nõrgendada või võimendada. ASM-i pildikogu näitab seda otseselt: segakultuuris võib E. coli kaotada oodatud läike, sest ümbritsevad organismid muudavad keskkonna happelisust.

Kaasa kontrollid alati, kui harjutus seda võimaldab. Levinud õppekomplekti kuuluvad E. coli ATCC 25922 sinakasmusta värvuse ja metalliläike fenotüübi kontrolliks, mittekääritaja, näiteks Salmonella Typhimurium ATCC 14028 või Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, värvitu fenotüübi kontrolliks ning grampositiivne organism, näiteks Enterococcus faecalis või Staphylococcus aureus, pärssimise kontrolliks, nagu on loetletud EMB-söötmete standardsetes kvaliteedikontrolli tabelites. Kui positiivsel kontrollil puudub läige, kahtlusta enne tundmatu organismi omadusi inkubeerimistingimusi, liiga tihedat kasvu või söötme koostist.

Illustratiivne plaadiatlas

Allolevad plaadid on genereeritud illustratsioonid, mitte fotod tegelikest kultuuridest. Need näitavad mustrit, mida otsida, mitte ühe konkreetse tüve täpset värvitooni. Võrdle neid ASM-i võrdlusfotodega ja õppelabori tegelike plaatidega.

Plaat 1: Escherichia coli EMB-agaril, intensiivne laktoosi kääritaja

E. coli on EMB-agaril tavaliselt tumelilla kuni sinakasmust, sageli tumeda keskosa ja intensiivsest happetootmisest tingitud metallrohelise läikega. See läige on tuntud tunnus, mida üliõpilased otsivad, kuid käsitle seda toetava tõendi, mitte määratlusena. Läike tugevus sõltub tüvest, inkubeerimisajast, kolooniate tihedusest ja vaatenurgast. Läike puudumine ei välista E. coli esinemist ning läiketa tume koloonia võib viidata mitmele teisele kääritajale. Vali edasisteks uuringuteks hästi eraldatud koloonia, mitte ära lähtu tiheda kasvuga sektorist.

Plaat 2: Klebsiella pneumoniae EMB-agaril, limane kääritaja

Klebsiella pneumoniae moodustab EMB-agaril tavaliselt suuri, läikivaid ja limaseid kolooniaid, mille toon ulatub roosakaslillast pruunikaslillani. Neil on sageli tumedad keskosad, kuid enamasti puudub tugev metalliläige. Sarnast morfoloogiat esineb lähedastel kääritajatel, näiteks Enterobacter'il. Limane tekstuur ja koloonia suurus kuuluvad tõlgendamise juurde: väikesel lamedal roosal koloonial on teistsugune tähendus kui suurel kumeral limasel koloonial. Nagu E. coli puhul, viitab plaat kääritamisfenotüübile ning liigitasemel määramine vajab allpool kirjeldatud biokeemilist kinnitamist.

Plaat 3: Salmonella EMB-agaril ja teised mittekääritajad, värvitud kolooniad

Salmonella EMB-agaril ja teised laktoosi mittekääritavad organismid, sealhulgas Shigella ja paljud Pseudomonas'e isolaadid, kasvavad tavaliselt värvitute, poolläbipaistvate või kahvatumerevaigukollaste kolooniatena. Mõne koostise ja tingimuse korral tekib nõrk roosakas varjund, mistõttu kahvaturoosa koloonia ei tähenda automaatselt kääritajat. EMB ei erista Salmonella't Shigella'st ega teistest mittekääritajatest; see eristamine jääb järgnevate testide ülesandeks. Arvesta ka sellega, et dokumenteeritud on laktoospositiivseid Salmonella tüvesid, mille metalliläikelised kolooniad meenutavad E. coli omi. See on veel üks põhjus, miks üks plaat ei anna lõplikku vastust.

Plaat 4: Serratia marcescens ja koostisest tulenev lõks

Serratia marcescens väärib omaette jaotist, sest üliõpilased ootavad sageli punaseid kolooniaid ja tõlgendavad seejärel plaati valesti. Enamik kliinilisi isolaate ei käärita laktoosi, mistõttu näevad need Levine'i EMB-l tavaliselt välja kahvatud kuni nõrgalt värvunud. Kuna paljud isolaadid kääritavad sahharoosi, võib sahharoosi sisaldav koostis anda tumedama või tugevama happetekkele viitava reaktsiooni. Ära oota ka klassikalist punast prodigiosiini pigmenti temperatuuril 35 kuni 37 C; inkubaatori temperatuuril ei ole pigmendi teke usaldusväärne. Kui protokoll kirjeldab Serratia marcescens'i EMB-agaril, kontrolli, millist koostist see väide eeldab. Serratia ainevahetuse ülevaade võtab kokku selle lõksu taga oleva laktoosnegatiivse ja varieeruva sahharoosi kääritamise mustri.

Plaat 5: kontrollid ja pärsitud organismid

Grampositiivsete organismide, näiteks Staphylococcus'e, Enterococcus'e, Streptococcus'e ja Bacillus'e kasv on EMB-agaril üldiselt pärsitud või märgatavalt piiratud, kuigi pärssimine ei ole iga tüve puhul täielik. Kontrollide komplekt aitab tulemusi usaldusväärselt tõlgendada: E. coli kontroll peaks näitama head kasvu sinakasmusta värvuse ja läikega, mittekääritaja kontroll peaks näitama värvitut kasvu ning pärssimise kontrollil peaks kasv olema vähene või puuduma. Kui pärssimise kontroll kasvab hästi, ei ole selektiivne toime toiminud ja kõik teised selle söötmepartii tulemused on kaheldavad. Värvimismeetodid vastavad teistsugusele küsimusele kui kultiveerimissöötmed; labori preparaatide värvimise kohta vaata metüleensinisega värvimise atlast.

Võrdlus ja selle piirid

Kolm lauset võtavad eksitavad välimused kokku. Tume ei võrdu E. coli'ga, sest Klebsiella, Enterobacter ja teised kääritajad moodustavad tumedaid keskosi ka ilma läiketa. Roosa ei võrdu Klebsiella'ga, sest mõõdukad või aeglased kääritajad ja mõned tavapäraselt mittekääritajateks peetavad organismid võivad olla roosad või kahvatulillad. Läige ei võrdu kindlalt E. coli'ga, sest seda võivad tekitada ka teised intensiivsed kääritajad. Õppeprotokoll ja selle segakultuuride pildid illustreerivad kõiki neid eksijäreldusi.

Kinnitamise piirid

EMB-agar näitab fenotüüpi, mitte liiki. Eri organismide kolooniad võivad välja näha ühesugused ning ühe organismi välimus võib tüve, vanuse, kasvutiheduse, söötme koostise ja inkubeerimise tõttu õpikupildist erineda. Seetõttu käsitletakse EMB morfoloogiat nii õppe- kui ka kliinilistes töövoogudes esialgse, mitte kinnitava leiuna.

Üliõpilase põhjendatud töövoog on järgmine: kirjelda eraldatud kolooniat (suurus, värvus, keskosa, läige kaldvalguses, limasus), märgi üles söötme koostis, inkubeerimisaeg ja temperatuur ning kontrollid; seejärel tee hästi eraldatud kolooniast puhaskultuuri saamiseks ümberkülv enne kinnitavaid teste. Levinud järgnevad uuringud hõlmavad Grami järgi värvimist ja IMViC-reaktsioone E. coli ning kolibakterite esialgseks määramiseks, TSI-d või KIA-d ja organismispetsiifilisi biokeemiliste testide paneele soolebakterite jaoks ning vajaduse korral seroloogilist, MALDI TOF-i või muud valideeritud määramismeetodit. Taustateavet EMB koha kohta selektiivsete ja diferentsiaalsete soolebakterite söötmete seas leiad soolebakterite kultiveerimissöötmete sissejuhatustest ning Grami järgi värvimisele järgnevatest uuringutest. Seotud küsimuse puhul, mida siniseks värvitud preparaat saab ja ei saa tõestada, hoiab metüleensinisega värvimise atlas samal põhimõttel vaatluse ja järelduse lahus.

Kirjuta tähelepanek enne järeldust. „Tumedad sinakasmustad kolooniad vaatenurgast sõltuva rohelise läikega Levine'i EMB-l 24 tunni järel, kooskõlas intensiivse laktoosi kääritamisega” on põhjendatud kirjeldus. „E. coli, kinnitatud” nõuab kinnitavat etappi, mida plaat üksi pakkuda ei saa.