Νέο κυανό του μεθυλενίου και χρώση δικτυοερυθροκυττάρων: μια διαφορετική χρωστική και μια μέθοδος για ζωντανά κύτταρα

Ένας φοιτητής ετοιμάζεται να καταμετρήσει δικτυοερυθροκύτταρα, παραγγέλνει κυανό του μεθυλενίου, το αναμειγνύει με αίμα και δεν βλέπει σχεδόν τίποτα. Ένας συμφοιτητής του χρησιμοποιεί ένα φιαλίδιο με την ένδειξη νέο κυανό του μεθυλενίου και παρατηρεί ευκρινή κυανά νημάτια σε ένα μέρος των ερυθροκυττάρων. Ο πρώτος φοιτητής υποθέτει ότι το δεύτερο φιαλίδιο είναι πιο φρέσκο ή πιο συμπυκνωμένο. Δεν ισχύει τίποτε από τα δύο. Περιέχει διαφορετικό μόριο.

Αυτό είναι το εννοιολογικό σφάλμα που προκαλεί τη μεγαλύτερη σύγχυση σε αυτό το πεδίο. Το όνομα υποδηλώνει ότι το νέο κυανό του μεθυλενίου είναι μια βελτιωμένη παρτίδα κυανού του μεθυλενίου. Η χημεία δείχνει κάτι διαφορετικό. Το νέο κυανό του μεθυλενίου N είναι ξεχωριστή φαινοθειαζινική χρωστική, με δικό της αριθμό Colour Index, δικό της πρότυπο υποκατάστασης και δικό της τυποποιημένο ρόλο στην αιματολογία. Μόλις αυτή η διάκριση γίνει σαφής, η υπόλοιπη μέθοδος —γιατί τα κύτταρα πρέπει να είναι ζωντανά κατά τη χρώση, τι θεωρείται δικτυοερυθροκύτταρο, ποια είναι η θέση των σωματίων Heinz και πότε χρησιμοποιείται το λαμπρό κυανό του κρεζυλίου— γίνεται εύκολα κατανοητή.

Η σύντομη απάντηση

Το νέο κυανό του μεθυλενίου N, το αιματολογικό αντιδραστήριο, προσδιορίζεται συνήθως ως Basic Blue 24 στην καταχώριση του PubChem για το νέο κυανό του μεθυλενίου, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, με τύπο C18H22ClN3S. Το κοινό κυανό του μεθυλενίου είναι χλωριούχο μεθυλοθειονίνιο, Basic Blue 9, στην καταχώρισή του στο PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, με τύπο C16H18ClN3S. Από δομική άποψη, το νέο κυανό του μεθυλενίου φέρει δύο μεθυλομάδες στον δακτύλιο και πλευρικές αιθυλαμινομάδες στις θέσεις όπου το κυανό του μεθυλενίου φέρει διμεθυλαμινομάδες. Αυτή η διαφορά μεταβάλλει τη συμπεριφορά κατά τη χρώση. Τα αιματολογικά συγγράμματα περιγράφουν το κοινό κυανό του μεθυλενίου ως σχετικά φτωχή χρωστική για τα δικτυοερυθροκύτταρα και το νέο κυανό του μεθυλενίου ως πιο έντονη και ομοιόμορφη, μια σύγκριση που συνοψίζεται στη θεματική ενότητα του ScienceDirect για το νέο κυανό του μεθυλενίου.

Ναι, το νέο κυανό του μεθυλενίου είναι υπερζωική χρωστική. Υπερζωική χρώση σημαίνει χρώση ζωντανών κυττάρων μετά την απομάκρυνσή τους από το σώμα και πριν από τη μονιμοποίηση, όπως ορίζεται στην ανασκόπηση του NCBI για τις αρχές της υπερζωικής χρώσης. Τόσο το νέο κυανό του μεθυλενίου όσο και το λαμπρό κυανό του κρεζυλίου ανήκουν σε αυτή την κατηγορία, ενώ το πρότυπο του CLSI για τα δικτυοερυθροκύτταρα καλύπτει ρητά το νέο κυανό του μεθυλενίου ως υπερζωική χρωστική. Οι φοιτητές μερικές φορές το κατατάσσουν μαζί με τη χρώση Romanowsky μονιμοποιημένων επιχρισμάτων. Αυτός ο τρόπος σκέψης δεν ισχύει εδώ. Αν προηγηθεί η μονιμοποίηση, η μέθοδος παύει να λειτουργεί.

Για τους αναγνώστες που εξετάζουν παρεμφερή ονόματα χρωστικών, η σύγκριση κυανού του μεθυλίου και κυανού του μεθυλενίου καλύπτει μια διαφορετική και ευρύτερη σύγχυση ανάμεσα σε μια ανιονική τριαρυλομεθανική χρωστική και την κατιονική οικογένεια των φαινοθειαζινών. Η επισκόπηση των εργαστηριακών χρώσεων παρουσιάζει την υπερζωική χρώση μαζί με τις μεθόδους μονιμοποιημένων επιχρισμάτων, ενώ ο οδηγός μορφολογίας των κυττάρων του αίματος δείχνει πού εντάσσεται η αξιολόγηση των δικτυοερυθροκυττάρων στην ευρύτερη διαφορική καταμέτρηση.

Μια επισήμανση για τους καταλόγους: υπάρχει ξεχωριστή μορφή του νέου κυανού του μεθυλενίου ως διπλού άλατος με χλωριούχο ψευδάργυρο, με CAS 6586-05-6. Επομένως, η ενότητα μεθόδων πρέπει να αναφέρει τη μορφή του άλατος και τον προμηθευτή, όχι μόνο την κοινή ονομασία.

Τι κάνει πραγματικά η υπερζωική χρώση

Το δικτυοερυθροκύτταρο είναι ένα νεαρό ερυθροκύτταρο που έχει χάσει τον πυρήνα του, αλλά διατηρεί υπολειμματικό ριβοσωμικό RNA. Σε ένα άχρωστο υγρό παρασκεύασμα, αυτό το RNA είναι αόρατο. Η υπερζωική χρωστική εισέρχεται στο ζωντανό κύτταρο και κατακρημνίζει ή συσσωματώνει αυτό το RNA σε κυανά κοκκία και νημάτια, το δικτυονηματοειδές υλικό που παρατηρείται με ελαιοκαταδυτικό φακό. Το δίκτυο είναι, επομένως, προϊόν της χρώσης και όχι ένας προϋπάρχων σκελετός που περιμένει να χρωματιστεί. Γι’ αυτό οι μεταβλητές του πρωτοκόλλου —συγκέντρωση χρωστικής, ρυθμιστικό διάλυμα, αναλογία αίματος προς χρωστική, θερμοκρασία, χρόνος— έχουν τόση σημασία όσο και το όνομα της χρωστικής.

Η πρακτική συνέπεια είναι μια αυστηρή σειρά ενεργειών: πρώτα αναμείξτε αίμα με αντιπηκτικό και χρωστική, επωάστε και κατόπιν παρασκευάστε επιχρίσματα και εξετάστε τα χωρίς μονιμοποίηση και χωρίς αντιχρώση. Η μονιμοποίηση πριν από τη χρώση ή μια αντιχρώση που καλύπτει τα αχνά νημάτια καταστρέφει την πληροφορία στην οποία βασίζεται η καταμέτρηση.

Ένα πρακτικό πρωτόκολλο δικτυοερυθροκυττάρων με νέο κυανό του μεθυλενίου

Δεν υπάρχει μία καθολική σύνθεση, επομένως αναφέρετε αυτήν που χρησιμοποιήθηκε. Τρεις τεκμηριωμένες παραλλαγές δείχνουν το εύρος.

Η κλασική διαδικασία τύπου Brecher χρησιμοποιεί περίπου 0.5 τοις εκατό νέο κυανό του μεθυλενίου με οξαλικό κάλιο, αναμεμειγμένο σε ίσους όγκους με καλά αναμεμειγμένο αίμα με EDTA, με επώαση περίπου 10 έως 15 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από ήπια επαναανάμειξη, παρασκευάζονται λεπτά σφηνοειδή επιχρίσματα, ξηραίνονται στον αέρα και εξετάζονται χωρίς μονιμοποίηση με τον ελαιοκαταδυτικό αντικειμενικό φακό 100x. Η διαδικασία του NCBI για την καταμέτρηση δικτυοερυθροκυττάρων περιγράφει αυτή τη ροή εργασίας και το πλαίσιο καταμέτρησης που χρησιμοποιείται μαζί της.

Η παραλλαγή Dacie και Lewis χρησιμοποιεί 1.0 τοις εκατό νέο κυανό του μεθυλενίου σε αλατούχο διάλυμα με κιτρικά, αναμεμειγμένο με 2 έως 4 όγκους αίματος και διατηρούμενο στους 37 C για 15 έως 20 λεπτά πριν από την παρασκευή επιχρισμάτων. Μια πρόσφατη εφαρμογή εναρμόνισης για τη διαδικασία CLSI H44 χρησιμοποίησε αραιότερο διάλυμα 0.1 τοις εκατό σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά σε pH 7.4, με επώαση στους 20 C για 10 λεπτά και χωρίς μονιμοποίηση, όπως αναφέρεται στη μελέτη εναρμόνισης του NMB του 2026.

Οι κανόνες καταμέτρησης είναι κοινοί σε όλες τις παραλλαγές. Καταγράψτε ένα κύτταρο ως δικτυοερυθροκύτταρο όταν περιέχει τουλάχιστον δύο διακριτά κυανά κοκκία ή τμήματα νηματίων, αποκλείοντας έτσι μια μεμονωμένη εναπόθεση χρωστικής. Στην εργασία ρουτίνας καταμετρήστε τουλάχιστον 1,000 ερυθροκύτταρα και αναφέρετε τα δικτυοερυθροκύτταρα ως ποσοστό. Σε χαμηλά ποσοστά, η στατιστική απαιτεί περισσότερα κύτταρα. Μια ανασκόπηση της μεθοδολογίας CLSI H44 σημειώνει ότι, κοντά στο 1 τοις εκατό δικτυοερυθροκυττάρων, απαιτούνται περίπου 4,400 κύτταρα για να μειωθεί η διακύμανση της καταμέτρησης στο 5 τοις εκατό, στην ανασκόπηση του CLSI H44 στο De Gruyter. Ένας προσοφθάλμιος δίσκος Miller διευκολύνει την καταμέτρηση μεγάλου αριθμού κυττάρων. Διηθήστε τη χρωστική ή παρασκευάστε την πρόσφατα, επειδή το ίζημα μιμείται κοκκώδη έγκλειστα.

Σωμάτια Heinz στο ίδιο παρασκεύασμα

Το ίδιο υπερζωικά χρωσμένο επίχρισμα μπορεί επίσης να αναδείξει σωμάτια Heinz, τα οποία είναι συσσωματώματα οξειδωμένης και μετουσιωμένης αιμοσφαιρίνης και όχι υπολειμματικό RNA. Σε παρασκευάσματα με νέο κυανό του μεθυλενίου εμφανίζονται ως στρογγυλά σωμάτια, συχνά μεμονωμένα και κοντά στη μεμβράνη, με ανοιχτότερη κυανή χρώση από το δικτυονηματοειδές υλικό. Δεν διατηρούνται καλά κατά τη μονιμοποίηση και την αντιχρώση, γι’ αυτό εξετάστε το μη μονιμοποιημένο επίχρισμα. Ένα πρόσφατο πρωτόκολλο που χρησιμοποίησε 20 μικρολίτρα αίματος με EDTA μαζί με 20 μικρολίτρα νέου κυανού του μεθυλενίου 1 τοις εκατό και επώαση 15 λεπτών προσδιόρισε ποσοτικά τα κύτταρα με σωμάτια Heinz μεταξύ 250 ερυθροκυττάρων, στη μελέτη του PMC που αναφέρει αυτή τη διαδικασία.

Δύο διακρίσεις αποτρέπουν τις λανθασμένες ερμηνείες. Πρώτον, το ιώδες του μεθυλίου και το κρυσταλλικό ιώδες χρωματίζουν τα σωμάτια Heinz εντονότερα από το νέο κυανό του μεθυλενίου, όπως σημειώνεται στη θεματική ενότητα του ScienceDirect για τα σωμάτια Heinz. Το νέο κυανό του μεθυλενίου είναι η πρακτική επιλογή όταν αξιολογούνται μαζί δικτυοερυθροκύτταρα και σωμάτια Heinz, όχι η ισχυρότερη χρωστική ειδικά για σωμάτια Heinz. Δεύτερον, τα έγκλειστα HbH στους φορείς άλφα θαλασσαιμίας εμφανίζονται ως πολυάριθμες λεπτές κουκκίδες σε όλο το κύτταρο μετά την υπερζωική χρώση, ενώ τα κλασικά σωμάτια Heinz είναι λιγότερα, μεγαλύτερα και συχνά συνδέονται με τη μεμβράνη. Η εναπόθεση χρωστικής είναι η τρίτη παραπλανητική εικόνα: βρίσκεται έξω από το εστιακό επίπεδο των κυττάρων και ποικίλλει από πεδίο σε πεδίο.

Λαμπρό κυανό του κρεζυλίου έναντι νέου κυανού του μεθυλενίου

Και οι δύο χρωστικές είναι υπερζωικές χρωστικές για δικτυοερυθροκύτταρα, αλλά η τυποποίηση ευνοεί τη μία από αυτές. Η μέθοδος δικτυοερυθροκυττάρων CLSI H44-A2, που αναπτύχθηκε από κοινού με το Διεθνές Συμβούλιο Τυποποίησης στην Αιματολογία και παρατίθεται στη σελίδα του προτύπου CLSI H44, ορίζει τη χρώση αίματος με EDTA με νέο κυανό του μεθυλενίου ως τη χειροκίνητη συγκριτική μέθοδο. Η κλασική διδασκαλία της αιματολογίας συμφωνεί ως προς την εικόνα: το νέο κυανό του μεθυλενίου δίνει πιο έντονη και ομοιόμορφη χρώση των νηματίων, ενώ το λαμπρό κυανό του κρεζυλίου παρουσιάζει μεγαλύτερη διακύμανση μεταξύ παρτίδων και δειγμάτων.

Αυτή η θέση χρειάζεται μια διευκρίνιση. Η κατευθυντήρια οδηγία του ICSH για την αξιολόγηση αναλυτών δέχεται τη χειροκίνητη μικροσκόπηση με νέο κυανό του μεθυλενίου ως προσέγγιση σύγκρισης αναφοράς, αλλά τη χαρακτηρίζει υποκειμενική και σχετικά χαμηλής επαναληψιμότητας, προτιμώντας διαδικασίες αναφοράς με κυτταρομετρία ροής όπου είναι διαθέσιμες. Μια σύγκριση 100 δειγμάτων το 2022 διαπίστωσε μικρότερη συστηματική απόκλιση από τον αναλυτή της με το λαμπρό κυανό του κρεζυλίου απ’ ό,τι με το νέο κυανό του μεθυλενίου, όπως αναφέρεται στη σύγκριση μεθόδων χρώσης στο PMC. Η τεκμηριωμένη σύνοψη για τους φοιτητές: χρησιμοποιήστε το νέο κυανό του μεθυλενίου ως τυποποιημένη χειροκίνητη μέθοδο σύγκρισης, επαληθεύστε κάθε τοπική μέθοδο με λαμπρό κυανό του κρεζυλίου έναντι αυτής ή έναντι αυτοματοποιημένης μεθόδου και αναμένετε μεγαλύτερη διασπορά από τη χειροκίνητη μικροσκόπηση σε κάθε περίπτωση. Παλαιότερη βιβλιογραφία τυποποίησης υποστήριζε επίσης το καθαρισμένο Azure B ως χημικά καθαρότερη εναλλακτική, επειδή οι εμπορικές παρτίδες χρωστικών παρουσίαζαν διαφορές, στη μελέτη του Marshall για το Azure B, γεγονός που εξηγεί γιατί ο βαθμός καθαρότητας του αντιδραστηρίου εξακολουθεί να αναφέρεται στις συζητήσεις για τις μεθόδους.

Αποφυγή των συνηθισμένων σφαλμάτων

Τέσσερα λάθη ευθύνονται για τα περισσότερα αποτυχημένα παρασκευάσματα. Η παραγγελία κοινού κυανού του μεθυλενίου αντί για νέο κυανό του μεθυλενίου N οδηγεί σε ασθενή χρώση λόγω της χημείας, όχι της τεχνικής. Η μονιμοποίηση ή η αντιχρώση πριν από την εξέταση αφαιρεί το υπερζωικό σήμα. Η καταμέτρηση ιζήματος χρωστικής ως κοκκίων αυξάνει πλασματικά το αποτέλεσμα, κάτι που αποτρέπουν ο κανόνας των δύο κοκκίων και η διηθημένη χρωστική. Η καταμέτρηση πολύ λίγων κυττάρων σε χαμηλά ποσοστά δικτυοερυθροκυττάρων παράγει έναν αριθμό που φαίνεται ακριβής, αλλά έχει ευρέα όρια εμπιστοσύνης. Κάθε σφάλμα έχει το ίδιο χαρακτηριστικό: ο μικροσκοπιστής κατηγορεί το μικροσκόπιο για κάτι που καθορίστηκε στο στάδιο του αντιδραστηρίου.